人參炔醇對(duì)胰腺癌干細(xì)胞分化及侵襲轉(zhuǎn)移作用的基礎(chǔ)研究.pdf

1、研究目的：
　　近年來(lái)，隨著在胰腺癌中證實(shí)有腫瘤干細(xì)胞（CSC）的存在，對(duì)胰腺癌復(fù)發(fā)、侵襲轉(zhuǎn)移形成產(chǎn)生了新的認(rèn)識(shí)和研究方向。中藥干預(yù)胰腺癌干細(xì)胞的研究也越來(lái)越多。本研究通過(guò)體外探討人參炔醇（PNN Panaxynol）對(duì)胰腺癌干細(xì)胞增殖活性的作用，并進(jìn)一步探討其對(duì)胰腺癌干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力及干性的影響，從而為人參炔醇干預(yù)治療胰腺癌進(jìn)一步提供有效的理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法：
　　本研究通過(guò)以腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)記分子

2、CD133為篩選標(biāo)記，從胰腺癌細(xì)胞系Panc-1細(xì)胞中分離出 CD133陽(yáng)性細(xì)胞，在體外通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞周期及干性相關(guān)蛋白Oct4、CD133的表達(dá)進(jìn)一步進(jìn)行鑒定。然后用人參炔醇干預(yù)胰腺癌干細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)篩選出最佳作用濃度及時(shí)間；進(jìn)而探討其對(duì)胰腺癌干細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移及體外分化的作用。
　?。?）無(wú)血清培養(yǎng)法培養(yǎng)和富集胰腺癌細(xì)胞系Panc-1干細(xì)胞。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)培養(yǎng)的胰腺癌Panc-1細(xì)胞的表面標(biāo)記分子CD133表達(dá)情況。

3、>　?。?）采用流式細(xì)胞分選術(shù)分選及鑒定胰腺癌干細(xì)胞；將分選出的細(xì)胞培養(yǎng)于無(wú)血清的培養(yǎng)基中，適時(shí)傳代。
　　（3）Western-Blot檢測(cè)分選出的CD133+細(xì)胞內(nèi)干性相關(guān)蛋白Oct4及CD133的表達(dá)情況。
　　（4）流式細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)觀察分選出的CD133+細(xì)胞的周期分布情況。
　　（5）采用CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察胰腺癌干細(xì)胞經(jīng)人參炔醇干預(yù)后其增殖活性的影響，篩選其最佳作用濃度及時(shí)間。
　?。?）Transwe

4、ll侵襲及遷移實(shí)驗(yàn)觀察胰腺癌干細(xì)胞經(jīng)人參炔醇干預(yù)后其遷移及侵襲能力的影響。
　?。?）Western-Blot檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞經(jīng)人參炔醇干預(yù)后其增殖相關(guān)蛋白PCNA及遷移相關(guān)蛋白E-Cadherin、N-Cadherin及Vimentin表達(dá)的變化。
　?。?）采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞經(jīng)人參炔醇干預(yù)后其干細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD133的變化。
　?。?）Western-Blot檢測(cè)胰腺癌干細(xì)胞經(jīng)人參炔醇干預(yù)后其干性相

5、關(guān)蛋白Oct4及CD133表達(dá)的變化。
　　研究結(jié)果：
　　（1）無(wú)血清培養(yǎng)法培養(yǎng)一段時(shí)間后，細(xì)胞呈球生長(zhǎng)，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明無(wú)血清培養(yǎng)法能夠有效的富集CD133表型的胰腺癌細(xì)胞。
　?。?）流式細(xì)胞分選術(shù)分選出的CD133+細(xì)胞純度＞98％。
　?。?）Western-Blot檢測(cè)分選出的CD133+細(xì)胞內(nèi)干性相關(guān)蛋白Oct4及CD133表達(dá)明顯高于對(duì)照組。
　?。?）流式細(xì)胞周期試驗(yàn)顯示CD133+細(xì)胞

6、大多處于細(xì)胞周期靜止期（G0/G1期）。
　?。?）CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示人參炔醇可以抑制胰腺癌干細(xì)胞的增殖活性并且呈濃度依賴性，且以人參炔醇濃度為80μg/mL作用48h后作用最明顯。
　?。?）Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示人參炔醇可以有效抑制胰腺癌干細(xì)胞的遷移及侵襲能力并且呈濃度依賴性，且以其濃度為80μg/mL作用48h后作用最明顯。
　?。?）Western-Blot結(jié)果顯示胰腺癌干細(xì)胞經(jīng)人參炔醇干預(yù)后其增殖相關(guān)

7、蛋白PCNA表達(dá)下調(diào)，遷移相關(guān)蛋白 E-Cadherin表達(dá)上調(diào)及 N-Cadherin、Vimentin表達(dá)下調(diào)。
　　（8）流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示胰腺癌干細(xì)胞經(jīng)人參炔醇干預(yù)后CD133表達(dá)減少。
　?。?）Western-Blot結(jié)果顯示胰腺癌干細(xì)胞經(jīng)人參炔醇干預(yù)后其干性相關(guān)蛋白Oct4及CD133表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：
　?。?）本研究使用干細(xì)胞表面標(biāo)記分子 CD133成功分選和鑒定胰腺癌干細(xì)胞，分選出的CD