PanIN--3和胰腺癌中異常表達的miRNAs的篩查、驗證及miR--1290在胰腺癌中的作用與機制研究.pdf

1、背景:
　　胰腺癌是一種較為常見的高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，其五年生存率不足5％，中位生存期小于6個月。胰腺癌最常見的組織學類型為胰腺導管腺癌(PDAC)，約占所有胰腺癌病例的85％-90％。患者死亡率高、預(yù)后差的主要原因是該疾病早期缺乏特異性臨床癥狀和診斷及預(yù)后相關(guān)的分子標志物，大部分患者在診斷時腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而失去了手術(shù)機會,而且該腫瘤對放、化療反應(yīng)性差，極易復發(fā)轉(zhuǎn)移。近年來，隨著醫(yī)學的發(fā)展，人類大多數(shù)惡性腫瘤患者的生存期有

2、了顯著增加，但胰腺癌患者的生存期并無明顯改善，因此胰腺癌早期診斷及治療成為亟待解決的問題。研究顯示，胰腺上皮內(nèi)瘤變（PanIN），尤其是高級別上皮內(nèi)瘤變(PanIN-3)，是胰腺導管腺癌最常見的非侵襲性癌前病變。早期診斷和手術(shù)切除可將胰腺癌患者的生存率由Ⅳ期的6％提高到Ⅰ期的50％左右。若能找到胰腺癌特異性的分子標志物并在癌前病變階段對該疾病進行診斷或有針對性的對胰腺癌高危人群進行篩查，胰腺癌患者的生存狀況將會得到大大改善。此外，胰腺癌

3、的發(fā)生發(fā)展涉及多種癌基因、抑癌基因以及表觀遺傳學等改變，探索胰腺癌的發(fā)病機制，將為胰腺癌診斷治療提供新的思路。
　　MicroRNA(miRNA)是一組內(nèi)源性的非編碼的單鏈小RNA分子，長度為19-24個核苷酸，主要通過與其靶標mRNA的3'UTR區(qū)域互補結(jié)合，導致mRNA的降解或翻譯的抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)30％的蛋白質(zhì)編碼基因的表達而發(fā)揮作用。一個miRNA可能對應(yīng)多個靶點，同時，多個miRNA也可能作用于同一個靶點。miRN

4、A的異常表達與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要過程息息相關(guān)，例如胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等。目前研究表明，miR-21，miR-155，miR-196a和miR-210在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，或可作為胰腺癌潛在的分子標記物。然而多種研究中特異性miRNAs的一致性較差，應(yīng)用中其敏感性和特異性仍有待提高。因此，本研究主要致力于發(fā)現(xiàn)更有優(yōu)勢的胰腺癌尤其是PanIN-3特異性的miRNAs并探索其作用機制，為胰腺癌的診斷、治療和預(yù)

5、后判斷提供新的切入點。
　　目的:
　　篩查PanIN-3及胰腺癌組織中異常表達的miRNAs，并在胰腺癌組織和外周血漿中進行驗證，研究其對胰腺癌生物學特性的影響，并分析其相對表達量與胰腺癌臨床病理指標間的相關(guān)性，再通過生物信息學方法尋找并鑒定其下游作用的靶基因，進一步探尋其作用機制。
　　方法:
　　1.利用miRNA芯片技術(shù)篩查PanIN-3及胰腺癌組織中較胰腺正常導管及低級別上皮內(nèi)瘤變組織中顯著差異表達的m

6、iRNAs。
　　2.利用原位雜交和實時熒光定量PCR技術(shù)，在胰腺癌患者石蠟包埋組織和外周血漿中進一步驗證上述miRNAs的表達情況，獲得可能作為診斷標志物的候選miRNAs，并分析其診斷效能。
　　3.結(jié)合胰腺癌患者臨床病理資料，分析候選miR-1290的相對表達量與胰腺癌臨床病理指標間的相關(guān)性。
　　4.通過細胞學實驗:觀察miR-1290對胰腺癌細胞株生長、增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學特性的影響。
　　5

7、.通過動物實驗:研究miR-1290對胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型腫瘤生物學特性的影響。
　　6.利用生物信息學(MiRDB，Targetscan，MiRanda)分析技術(shù)，預(yù)測miR-1290可能的下游靶基因，并利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)分析其與miR-1290的關(guān)系，并進一步驗證其對胰腺癌生物學行為的影響。
　　7.利用實時熒光定量PCR、Western Blot以及免疫組織化學技術(shù)，分析miR-1290及其靶基因在胰腺癌及癌

8、旁正常組織中的表達情況，探討其臨床意義。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA芯片結(jié)果顯示:與正常胰腺導管上皮和低級別上皮內(nèi)瘤變相比，PanIN-3和胰腺癌中表達明顯上調(diào)或者下調(diào)（超過5倍）的miRNAs有30余種，結(jié)合文獻，篩選出其中的19條作為候選miRNAs。其中上調(diào)的主要有miR-31-5p，miR-29a-5p，miR-21-5p,miR-200b-3p,miR-192-5p,miR-146b-5p,miR-1290,m

9、iR-101-3p,1et-7a-5p,miR-196a-3p，miR-29a-3p，miR-34a-3p，miR-155;下調(diào)的主要有miR-105-3p，miR-216a-5p,miR-218-2-3p,miR-34a-5p,miR-513c-3p和miR-887。
　　2.原位雜交結(jié)果顯示:以“PanIN-3和癌組織中表達明顯高于正常導管上皮和低級別上皮內(nèi)瘤變(PanIN-1和PanIN-2)”作為判定標準，篩選出高表達的m

10、iRNAs共計6條，包括miR-31-5p，miR-101-3p，miR-1290，miR-34a-3p，miR-21-5p以及miR-155。
　　3.血漿實時熒光定量PCR驗證結(jié)果顯示:胰腺癌患者外周血漿中，miR-21-5p、miR-31-5p、miR-155和miR-1290表達均明顯增高，差異具有統(tǒng)計學意義。繪制ROC曲線比較其診斷效能，miR-31-5p和miR-1290具有相對較好的診斷效能，AUC分別為0.848和

11、0.829。
　　4.組織實時熒光定量PCR驗證結(jié)果顯示:miR-31-5p和miR-1290均在胰腺導管腺癌組織中高表達，癌旁正常組織低表達，與外周血漿結(jié)果相一致，提示miR-31及miR-1290可能是參與高級別上皮內(nèi)瘤變向胰腺癌轉(zhuǎn)變這一過程的早期分子，具有成為胰腺癌早期診斷分子標志物的潛能。結(jié)合患者的臨床病理資料進一步發(fā)現(xiàn)miR-1290高表達與腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(p＜0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小等因

12、素無關(guān)。提示miR-1290可能參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　5.miR-1290對胰腺癌細胞株生物學特性的影響:(1)檢測五株胰腺癌細胞株中miR-1290的表達量，發(fā)現(xiàn)其在AsPC-1中表達最低，在PANC-1中表達最高，選取這兩株細胞分別進行過表達和抑制實驗。(2)驗證轉(zhuǎn)染效果:轉(zhuǎn)染miR-1290Agomir的細胞系中，miR-1290被成功過表達，轉(zhuǎn)染miR-1290Antagomir的細胞系中，miR-1290被成功抑制。

13、(3)平板克隆實驗結(jié)果顯示，過表達miR-1290可顯著促進細胞增殖和集落形成(p＜0.05)。(4)細胞增殖活性實驗結(jié)果顯示，miR-1290過表達，細胞增殖速度加快，24小時活細胞數(shù)量明顯高于對照組(p＜0.05);miR-1290抑制后，細胞增殖速度減慢，24小時活細胞數(shù)量明顯少于對照組(p＜0.05)。(5)細胞遷移及侵襲實驗結(jié)果顯示，過表達miR-1290可促進胰腺癌細胞遷移和侵襲(p＜0.05);抑制miR-1290，細胞遷

14、移和侵襲能力顯著下降(p＜0.05)。與細胞劃痕實驗趨勢一致。(6)凋亡實驗結(jié)果顯示，過表達或抑制miR-1290對細胞凋亡無明顯影響(p＞0.05)。
　　6.裸鼠皮下荷瘤實驗結(jié)果顯示:過表達miR-1290可增加胰腺癌細胞成瘤能力，形成的腫瘤體積更大(p＜0.05）;抑制miR-1290可減弱胰腺癌細胞成瘤能力，形成的腫瘤體積減小(p＜0.05)。
　　7.生物信息學結(jié)果顯示，IKKα可能為miR-1290的靶基因之一。

15、
　　9.IKKα對胰腺癌細胞功能學實驗結(jié)果顯示:(1)抑制IKKα在胰腺癌細胞系中的表達，可促進其增殖、遷移和侵襲;(2)過表達IKKα，可逆轉(zhuǎn)miR-1290對胰腺癌細胞系促增殖、遷移和侵襲的作用;(3)改變胰腺癌細胞系中miR-1290及IKKα的表達量，NF-κB信號通路相關(guān)的蛋白IKBα、P65和P50表達無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.通過miRNA芯片、原位雜交以及組織和血漿中差異性表達miRNAs的篩

16、查，6條miRNAs:miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p和miR-155在PanIN-3及胰腺癌中表達升高。
　　2.胰腺癌組織中差異性表達的miRNAs與胰腺癌患者血漿中差異性表達的miRNAs具有一致性，提示血漿中miRNAs有望成為胰腺癌診斷、治療和預(yù)后評估的分子標志物。
　　3.miR-1290在胰腺癌組織及胰腺癌患者外周血漿中表達均顯著升高，且其表達

17、水平與胰腺癌患者腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示miR-1290可能成為胰腺癌診斷及預(yù)后判斷的分子標志物。
　　4.miR-1290可通過促進胰腺癌細胞的增殖、遷移、侵襲以及成瘤能力，參與胰腺癌生物學行為的調(diào)控，其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中可能起著癌基因的作用。
　　5.IKKα可能是miR-1290的靶基因之一，其可直接被miR-1290抑制（結(jié)合位點為3'端843-849處），促進胰腺癌的增殖、遷移和侵襲，提示miR-1290