PanIN--3和胰腺癌中異常表達(dá)的miRNAs的篩查、驗(yàn)證及miR--1290在胰腺癌中的作用與機(jī)制研究.pdf

1、背景:
　　胰腺癌是一種較為常見的高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，其五年生存率不足5％，中位生存期小于6個(gè)月。胰腺癌最常見的組織學(xué)類型為胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)，約占所有胰腺癌病例的85％-90％?；颊咚劳雎矢?、預(yù)后差的主要原因是該疾病早期缺乏特異性臨床癥狀和診斷及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物，大部分患者在診斷時(shí)腫瘤已發(fā)生轉(zhuǎn)移，從而失去了手術(shù)機(jī)會(huì),而且該腫瘤對(duì)放、化療反應(yīng)性差，極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。近年來，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人類大多數(shù)惡性腫瘤患者的生存期有

2、了顯著增加，但胰腺癌患者的生存期并無明顯改善，因此胰腺癌早期診斷及治療成為亟待解決的問題。研究顯示，胰腺上皮內(nèi)瘤變（PanIN），尤其是高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(PanIN-3)，是胰腺導(dǎo)管腺癌最常見的非侵襲性癌前病變。早期診斷和手術(shù)切除可將胰腺癌患者的生存率由Ⅳ期的6％提高到Ⅰ期的50％左右。若能找到胰腺癌特異性的分子標(biāo)志物并在癌前病變階段對(duì)該疾病進(jìn)行診斷或有針對(duì)性的對(duì)胰腺癌高危人群進(jìn)行篩查，胰腺癌患者的生存狀況將會(huì)得到大大改善。此外，胰腺癌

3、的發(fā)生發(fā)展涉及多種癌基因、抑癌基因以及表觀遺傳學(xué)等改變，探索胰腺癌的發(fā)病機(jī)制，將為胰腺癌診斷治療提供新的思路。
　　MicroRNA(miRNA)是一組內(nèi)源性的非編碼的單鏈小RNA分子，長(zhǎng)度為19-24個(gè)核苷酸，主要通過與其靶標(biāo)mRNA的3'UTR區(qū)域互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯的抑制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)30％的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)而發(fā)揮作用。一個(gè)miRNA可能對(duì)應(yīng)多個(gè)靶點(diǎn)，同時(shí)，多個(gè)miRNA也可能作用于同一個(gè)靶點(diǎn)。miRN

4、A的異常表達(dá)與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要過程息息相關(guān)，例如胰腺癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等。目前研究表明，miR-21，miR-155，miR-196a和miR-210在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，或可作為胰腺癌潛在的分子標(biāo)記物。然而多種研究中特異性miRNAs的一致性較差，應(yīng)用中其敏感性和特異性仍有待提高。因此，本研究主要致力于發(fā)現(xiàn)更有優(yōu)勢(shì)的胰腺癌尤其是PanIN-3特異性的miRNAs并探索其作用機(jī)制，為胰腺癌的診斷、治療和預(yù)

5、后判斷提供新的切入點(diǎn)。
　　目的:
　　篩查PanIN-3及胰腺癌組織中異常表達(dá)的miRNAs，并在胰腺癌組織和外周血漿中進(jìn)行驗(yàn)證，研究其對(duì)胰腺癌生物學(xué)特性的影響，并分析其相對(duì)表達(dá)量與胰腺癌臨床病理指標(biāo)間的相關(guān)性，再通過生物信息學(xué)方法尋找并鑒定其下游作用的靶基因，進(jìn)一步探尋其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.利用miRNA芯片技術(shù)篩查PanIN-3及胰腺癌組織中較胰腺正常導(dǎo)管及低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變組織中顯著差異表達(dá)的m

6、iRNAs。
　　2.利用原位雜交和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，在胰腺癌患者石蠟包埋組織和外周血漿中進(jìn)一步驗(yàn)證上述miRNAs的表達(dá)情況，獲得可能作為診斷標(biāo)志物的候選miRNAs，并分析其診斷效能。
　　3.結(jié)合胰腺癌患者臨床病理資料，分析候選miR-1290的相對(duì)表達(dá)量與胰腺癌臨床病理指標(biāo)間的相關(guān)性。
　　4.通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn):觀察miR-1290對(duì)胰腺癌細(xì)胞株生長(zhǎng)、增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)特性的影響。
　　5

7、.通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn):研究miR-1290對(duì)胰腺癌裸鼠皮下荷瘤模型腫瘤生物學(xué)特性的影響。
　　6.利用生物信息學(xué)(MiRDB，Targetscan，MiRanda)分析技術(shù)，預(yù)測(cè)miR-1290可能的下游靶基因，并利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析其與miR-1290的關(guān)系，并進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)胰腺癌生物學(xué)行為的影響。
　　7.利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot以及免疫組織化學(xué)技術(shù)，分析miR-1290及其靶基因在胰腺癌及癌

8、旁正常組織中的表達(dá)情況，探討其臨床意義。
　　結(jié)果:
　　1.miRNA芯片結(jié)果顯示:與正常胰腺導(dǎo)管上皮和低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變相比，PanIN-3和胰腺癌中表達(dá)明顯上調(diào)或者下調(diào)（超過5倍）的miRNAs有30余種，結(jié)合文獻(xiàn)，篩選出其中的19條作為候選miRNAs。其中上調(diào)的主要有miR-31-5p，miR-29a-5p，miR-21-5p,miR-200b-3p,miR-192-5p,miR-146b-5p,miR-1290,m

9、iR-101-3p,1et-7a-5p,miR-196a-3p，miR-29a-3p，miR-34a-3p，miR-155;下調(diào)的主要有miR-105-3p，miR-216a-5p,miR-218-2-3p,miR-34a-5p,miR-513c-3p和miR-887。
　　2.原位雜交結(jié)果顯示:以“PanIN-3和癌組織中表達(dá)明顯高于正常導(dǎo)管上皮和低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(PanIN-1和PanIN-2)”作為判定標(biāo)準(zhǔn)，篩選出高表達(dá)的m

10、iRNAs共計(jì)6條，包括miR-31-5p，miR-101-3p，miR-1290，miR-34a-3p，miR-21-5p以及miR-155。
　　3.血漿實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示:胰腺癌患者外周血漿中，miR-21-5p、miR-31-5p、miR-155和miR-1290表達(dá)均明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。繪制ROC曲線比較其診斷效能，miR-31-5p和miR-1290具有相對(duì)較好的診斷效能，AUC分別為0.848和

11、0.829。
　　4.組織實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示:miR-31-5p和miR-1290均在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中高表達(dá)，癌旁正常組織低表達(dá)，與外周血漿結(jié)果相一致，提示miR-31及miR-1290可能是參與高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變向胰腺癌轉(zhuǎn)變這一過程的早期分子，具有成為胰腺癌早期診斷分子標(biāo)志物的潛能。結(jié)合患者的臨床病理資料進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-1290高表達(dá)與腫瘤的分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(p＜0.05)，而與年齡、性別、腫瘤大小等因

12、素?zé)o關(guān)。提示miR-1290可能參與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。
　　5.miR-1290對(duì)胰腺癌細(xì)胞株生物學(xué)特性的影響:(1)檢測(cè)五株胰腺癌細(xì)胞株中miR-1290的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)其在AsPC-1中表達(dá)最低，在PANC-1中表達(dá)最高，選取這兩株細(xì)胞分別進(jìn)行過表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)。(2)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果:轉(zhuǎn)染miR-1290Agomir的細(xì)胞系中，miR-1290被成功過表達(dá)，轉(zhuǎn)染miR-1290Antagomir的細(xì)胞系中，miR-1290被成功抑制。

13、(3)平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-1290可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和集落形成(p＜0.05)。(4)細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-1290過表達(dá)，細(xì)胞增殖速度加快，24小時(shí)活細(xì)胞數(shù)量明顯高于對(duì)照組(p＜0.05);miR-1290抑制后，細(xì)胞增殖速度減慢，24小時(shí)活細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組(p＜0.05)。(5)細(xì)胞遷移及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-1290可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞遷移和侵襲(p＜0.05);抑制miR-1290，細(xì)胞遷

14、移和侵襲能力顯著下降(p＜0.05)。與細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)趨勢(shì)一致。(6)凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)或抑制miR-1290對(duì)細(xì)胞凋亡無明顯影響(p＞0.05)。
　　6.裸鼠皮下荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:過表達(dá)miR-1290可增加胰腺癌細(xì)胞成瘤能力，形成的腫瘤體積更大(p＜0.05）;抑制miR-1290可減弱胰腺癌細(xì)胞成瘤能力，形成的腫瘤體積減小(p＜0.05)。
　　7.生物信息學(xué)結(jié)果顯示，IKKα可能為miR-1290的靶基因之一。

15、
　　9.IKKα對(duì)胰腺癌細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:(1)抑制IKKα在胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，可促進(jìn)其增殖、遷移和侵襲;(2)過表達(dá)IKKα，可逆轉(zhuǎn)miR-1290對(duì)胰腺癌細(xì)胞系促增殖、遷移和侵襲的作用;(3)改變胰腺癌細(xì)胞系中miR-1290及IKKα的表達(dá)量，NF-κB信號(hào)通路相關(guān)的蛋白IKBα、P65和P50表達(dá)無明顯變化。
　　結(jié)論:
　　1.通過miRNA芯片、原位雜交以及組織和血漿中差異性表達(dá)miRNAs的篩

16、查，6條miRNAs:miR-31-5p,miR-101-3p,miR-1290,miR-34a-3p,miR-21-5p和miR-155在PanIN-3及胰腺癌中表達(dá)升高。
　　2.胰腺癌組織中差異性表達(dá)的miRNAs與胰腺癌患者血漿中差異性表達(dá)的miRNAs具有一致性，提示血漿中miRNAs有望成為胰腺癌診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物。
　　3.miR-1290在胰腺癌組織及胰腺癌患者外周血漿中表達(dá)均顯著升高，且其表達(dá)

17、水平與胰腺癌患者腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示miR-1290可能成為胰腺癌診斷及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。
　　4.miR-1290可通過促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及成瘤能力，參與胰腺癌生物學(xué)行為的調(diào)控，其在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中可能起著癌基因的作用。
　　5.IKKα可能是miR-1290的靶基因之一，其可直接被miR-1290抑制（結(jié)合位點(diǎn)為3'端843-849處），促進(jìn)胰腺癌的增殖、遷移和侵襲，提示miR-1290