ALDOA在胰腺癌中表達(dá)的意義和功能的初步研究.pdf

1、胰腺癌是一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，預(yù)后極差。在西方國(guó)家，胰腺癌排名惡性腫瘤死因的第4位。2011年，美國(guó)胰腺癌新發(fā)病例數(shù)為44030例，死亡37660例，5年生存率僅有6％。隨著近年來(lái)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，污染的加重，生活習(xí)慣的西方化，中國(guó)胰腺癌的發(fā)病率也逐年上升。據(jù)上海市流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2009年上海市胰腺癌發(fā)病率已上升至男性17.28/10萬(wàn)，女性14.04/10萬(wàn)。強(qiáng)烈的局部侵襲能力和早期轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致胰腺癌病人極差預(yù)后的主要原因，大部

2、分胰腺癌患者在得到診斷的時(shí)候因發(fā)現(xiàn)有局部侵犯或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而不能獲得根治性手術(shù)切除。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展是多因素在多階段作用的過(guò)程，包括癌基因的活化、抑癌基因的失活以及突變。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)展，研究領(lǐng)域的不斷開(kāi)拓，越來(lái)越多的新基因和基因的新功能被大家所發(fā)現(xiàn)。基于干預(yù)相關(guān)基因功能的分子靶向治療給胰腺癌患者帶來(lái)了曙光。如果將分子靶向治療和傳統(tǒng)治療方式聯(lián)合很有可能會(huì)改善胰腺癌的預(yù)后，提高胰腺癌患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量。醛縮酶A(aldolase A

3、，ALDOA)，指參與催化裂解1.6-二磷酸-D-果糖，生成3-磷酸-D-甘油醛和α-二羥丙酮磷酸的酶。是一種幾乎存在于一切生物體中并參與其糖酵解的重要酶。醛縮酶A參與了許多細(xì)胞功能，如肌肉的維持，橫紋肌的收縮，細(xì)胞形態(tài)和運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)，ATP的合成及肌動(dòng)蛋白絲的組織。ALDOA已被證實(shí)在人體絕大部分組織器官均有不同程度的表達(dá)，并且在多種惡性腫瘤中異常高表達(dá)，其表達(dá)高低被認(rèn)為和多種惡性腫瘤的分化、TNM分期及預(yù)后相關(guān)。目前的研究表明ALDO

4、A可能通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路而影響腫瘤的發(fā)生、增殖、抗凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成、耐藥等多個(gè)環(huán)節(jié)。ALDOA很可能作為一個(gè)廣譜性的標(biāo)志物，在惡性腫瘤的診斷、治療及預(yù)測(cè)預(yù)后中發(fā)揮巨大作用。目前國(guó)內(nèi)外尚未有ALDOA與胰腺癌發(fā)病的相關(guān)報(bào)道。在本課題中，我們首先通過(guò)高通量組織芯片免疫組織化學(xué)技術(shù)分析了ALDOA在胰腺癌和配對(duì)癌旁組織的表達(dá)模式，以及ALDOA在癌組織中表達(dá)高低與患者臨床病理特征的關(guān)系和潛在預(yù)測(cè)預(yù)后的價(jià)值，證實(shí)ALDOA評(píng)分和分化

5、及TNM分期相關(guān)，并且是胰腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素。其次，我們檢測(cè)了ALDOA在不同胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)差異，選取高表達(dá)ALDOA的胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1和MIAPaCa-2為研究對(duì)象，采用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建ALDOA的RNAi慢病毒載體，并獲得了穩(wěn)定干擾ALDOA表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株。最后，我們通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究抑制ALDOA表達(dá)后，胰腺癌細(xì)胞的增殖凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化，證實(shí)了干擾胰腺癌中ALDOA的表達(dá)，可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲

6、轉(zhuǎn)移。ALDOA作為胰腺癌的獨(dú)立預(yù)后因素以及潛在治療靶點(diǎn)，值得我們進(jìn)一步研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：ALDOA在胰腺癌臨床組織中的表達(dá)及臨床意義。
　　目的：研究胰腺癌中ALDOA在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)差異，分析ALDOA與胰腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。
　　方法：通過(guò)組織芯片免疫組化染色檢測(cè)96對(duì)胰腺癌及配對(duì)癌旁組織中的ALDOA蛋白水平的表達(dá)情況。使用秩和檢驗(yàn)分析ALDOA染色評(píng)分和CA19

7、-9高低、TNM分期、腫瘤分化、生存時(shí)間等臨床病理資料的相關(guān)性，累計(jì)生存時(shí)間和累計(jì)生存率采用Kaplan-Meier法，生存檢驗(yàn)采用Log-rank法，采取Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素分析。
　　結(jié)果：組織芯片免疫組化結(jié)果提示:ALDOA在胰腺癌組織的表達(dá)水平要高于配對(duì)癌旁組織（高表達(dá)率:癌64/96，66.7％;癌旁32/96，33.3％），ALDOA在胰腺癌組織中主要在細(xì)胞漿表達(dá)較明顯，而在癌旁正常導(dǎo)管中，ALDOA染

8、色較淺，且一般為均勻分布于細(xì)胞漿中。胰腺癌組織ALDOA蛋白高表達(dá)（染色指數(shù)＞6）與生存時(shí)間短(p＜0.001)，腫瘤細(xì)胞分化差（P=0.026）相關(guān)。Kaplan-Meier法分析ALDOA評(píng)分高低(p＜0.001)、腫瘤分化高低(p＜0.001)、TNM分期早晚（P=0.004）的患者生存時(shí)間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步行Cox回歸多因素分析提示ALDOA是胰腺癌患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.379，95％ CI=1.357-

9、4.170，P=0.002)。
　　結(jié)論：在人胰腺癌組織中ALDOA蛋白表達(dá)普遍高于癌旁組織，主要表達(dá)在胞漿。ALDOA的高表達(dá)與的臨床病理因素（分化差、TNM分期晚）顯著相關(guān)。ALDOA染色評(píng)分與患者的預(yù)后密切相關(guān)，是胰腺癌患者術(shù)后死亡風(fēng)險(xiǎn)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。
　　第二部分：干擾ALDOA表達(dá)對(duì)胰腺癌惡性潛能的影響。
　　目的：構(gòu)建ALDOA基因特異性shRNA真核表達(dá)載體，建立穩(wěn)定干擾ALDOA表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞，研究干

10、擾ALDOA對(duì)于胰腺癌細(xì)胞系PANC-1和MIAPaCa-2體外增殖、周期、凋亡、遷移和侵襲能力的影響;初步探索胰腺癌中干擾ALDOA后增殖、轉(zhuǎn)移、周期相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　方法：Western blot檢測(cè)人胰腺癌細(xì)胞系中ALDOA的表達(dá)，選擇高表達(dá)ALDOA的細(xì)胞系為后續(xù)研究對(duì)象。設(shè)計(jì)合成ALDOA基因特異性的shRNA序列，以慢病毒載體pLKO.1TRC cloning vector為基礎(chǔ)構(gòu)建ALDOA基因特異性shRNA重

11、組真核表達(dá)載體。包裝生成相應(yīng)慢病毒并轉(zhuǎn)染胰腺癌細(xì)胞系，嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)重組載體的胰腺癌細(xì)胞系。通過(guò)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，PI染色法分析細(xì)胞周期，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞增殖和群體依賴(lài)性變化，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞遷移能力。利用Western blot檢測(cè)E-cadherin，Snail和CyclinD1的表達(dá)變化，探索胰腺癌中干擾ALDOA對(duì)增值及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。免疫組化驗(yàn)證ALDOA與E-cadherin相關(guān)性。
　　

12、結(jié)果：Western blot結(jié)果顯示在6株胰腺癌細(xì)胞系中PANC-1和MIAPaCa-2中ALDOA蛋白含量最高。設(shè)計(jì)合成的ALDOA基因特異性shRNA單鏈成功退火形成雙鏈shRNA。用重組質(zhì)粒包裝慢病毒并成功轉(zhuǎn)染PANC-1和MIAPaCa-2細(xì)胞，采用嘌呤霉素成功篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)重組質(zhì)粒的胰腺癌細(xì)胞株。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提示，下調(diào)ALDOA表達(dá)水平后，不同時(shí)間點(diǎn)的PANC-1和MIAPaCa-2細(xì)胞系的增殖能力明顯減弱。細(xì)胞

13、周期分析提示:干擾ALDOA后，人胰腺癌細(xì)胞PANC-1和MIAPaCa-2均出現(xiàn)G1增多，G2和S期減少，發(fā)生G1期阻滯。平板克隆實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALDOA表達(dá)的下調(diào)明顯抑制了PANC-1和MIAPaCa-2的增殖以及增加了其群體依賴(lài)性。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)ALDOA表達(dá)減少后PANC-1和MIAPaCa-2遷移能力明顯減弱。Western blot檢測(cè)干擾ALDOA后Snail和CyclinD1下調(diào)，E-cadherin上調(diào)，提示胰腺癌中ALD

14、OA可以通過(guò)調(diào)控周期、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因從而影響胰腺癌的生物學(xué)行為。通過(guò)免疫組化染色進(jìn)一步驗(yàn)證ALDOA高表達(dá)的組織E-cadherin呈現(xiàn)相對(duì)低表達(dá)，而ALDOA低表達(dá)的組織E-cadherin呈現(xiàn)高表達(dá)?；匮a(bǔ)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證明ALDOA與胰腺癌EMT密切相關(guān)，并且ALDOA是通過(guò)其催化活性的改變影響EMT表型從而影響胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的。
　　結(jié)論：以ALDOA為靶點(diǎn)的RNAi可以有效抑制人胰腺癌細(xì)胞PANC-1和MiaPaCa-2的