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文檔簡介
1、microRNAs(miRNAs)是由21-25個核苷酸組成的非編碼RNA,它通過與靶基因的3’-UTR的配對,促進mRNA的降解或抑制mRNA的翻譯從而抑制其靶基因的表達。近年來,其與各種疾病的關(guān)系,尤其是與腫瘤的關(guān)系的研究成為熱點。胰腺癌是臨床上治療困難的疾病,對人類的健康威脅極大,大量研究工作集中于胰腺癌的腫瘤編碼基因的篩查和功能的鑒定,關(guān)于miRNAs與此疾病的關(guān)系知之甚少,研究miRNAs在胰腺癌發(fā)病機制中的作用具有重要的意義
2、。
本實驗以臨床上胰腺癌組織標本和國際上公認的ATCC胰腺癌細胞系Panc-l/Mia PaCa-2為實驗對象,用miRNAs芯片篩查胰腺癌組織與正常胰腺組織中差異表達的miRNAs。設(shè)定閾值1.5倍,SAM軟件分析找到32個差異表達的miRNAs,與對照組比較,其中上調(diào)的有18個,下調(diào)的有14個。Northern Blotting實驗驗證了部分的芯片結(jié)果:挑選了5個miRNAs分子,其中4個與芯片結(jié)果完全一致,一個結(jié)果有
3、出入。
依據(jù)K-RAS改變是胰腺癌中最典型的特征,并且是導(dǎo)致胰腺癌腫瘤惡性行為的一個關(guān)鍵因素,我們檢測了胰腺癌細胞系中K-RAS蛋白水平,有文獻報道K-RAS基因是let-7的一個靶基因,因此我們又檢測了胰腺癌細胞系中l(wèi)et-7 miRNA的水平,發(fā)現(xiàn)與K-RAS的蛋白表達水平成負向關(guān)系;接著我們用let-7 miRNA直接導(dǎo)入胰腺癌細胞系Panc-l,檢測到K-RAS的蛋白水平下降,而K-RAS的mRNA水平無明顯變化,
4、說明let-7的降低是胰腺癌中K-RAS蛋白升高的原因之一。
我們又檢測了胰腺癌細胞系以及正常胰腺組織中miR-96的表達水平,發(fā)現(xiàn)其在正常胰腺組織比胰腺癌細胞系中的表達下降。用質(zhì)粒為載體在Mia PaCa-2細胞中高表達miR-96,結(jié)果發(fā)現(xiàn)K—RAS的mRNA水平不變、而蛋白水平下降,腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為(增殖、克隆形成能力、遷移和侵襲能力)受到了明顯的抑制,同時腫瘤細胞凋亡增強;我們又檢測了RAS下游通路中的兩個
5、重要分子ERK和AKT的表達有顯著下降,它們的活化形式phospho-ERK和phospho-AKT也有不同程度的下降。生物信息學(xué)分析miR-96的前體序列發(fā)現(xiàn),各物種間存在多個位點核苷酸的多態(tài)性,且位于前體的莖環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū),但是成熟體的序列十分保守(>99%序列相同),小鼠的miR-96成熟體序列與人的序列完全一致,因此推測miR-96可能是進化過程中保留下來的具有腫瘤抑制功能的重要分子。
綜合前面的結(jié)果,我們得出在胰腺癌中
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