胰腺癌發(fā)病中Hedgehog-Gli1信號(hào)通路效應(yīng)MicroRNAs的篩選與鑒定.pdf

1、第一部分、胰腺癌HH信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1的效應(yīng)miRNAs的篩選
　　目的:應(yīng)用Affymetrix miRNA3.0和Affymetrix HTA2.0芯片技術(shù)對(duì)胰腺癌細(xì)胞中提取的總RNA進(jìn)行檢測(cè)，差異篩選得到HH信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1的候選效應(yīng)miRNAs，在此基礎(chǔ)上篩選獲得候選效應(yīng)miRNA的靶基因集合。
　　方法:參加檢測(cè)的RNA分別來(lái)源于胰腺癌SW1990和Panc-1細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為SW1990細(xì)胞轉(zhuǎn)染G

2、il1過(guò)表達(dá)載體和Panc-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染Gil1過(guò)表達(dá)載體，對(duì)照組為SW1990細(xì)胞和Panc-1細(xì)胞，對(duì)兩組實(shí)驗(yàn)共12個(gè)RNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，后續(xù)根據(jù)檢測(cè)相關(guān)系數(shù)與P值進(jìn)行差異篩選，獲得候選效應(yīng)miRNAs和相應(yīng)效應(yīng)miRNAs的靶基因集合。
　　結(jié)果:
　　1.RNA樣品質(zhì)檢合格。
　　2.Affymetrix miRNA2.0芯片質(zhì)量控制結(jié)果合格。
　　3.Affymetrix HTA3.0芯片樣品質(zhì)控合格;芯

3、片質(zhì)量及雜交情況可靠。
　　4.獲得具有Gli1結(jié)合位點(diǎn)的效應(yīng)miRNAs3個(gè)即has-mir-301a-3p，has-mir-29b-1-5p，has-mir-1228-3p。5.獲得效應(yīng)miRNAs的正負(fù)相關(guān)靶基因集合。
　　結(jié)論:在Affymetrix miRNA3.0和Affymetrix HTA2.0芯片技術(shù)的輔助下，準(zhǔn)確、高效、完整地為我們提供了HH-Gil1的效應(yīng)miRNAs及其相應(yīng)靶基因集合，為我們后續(xù)研究奠

4、定了扎實(shí)的基礎(chǔ)。
　　第二部分、胰腺癌HH信號(hào)通路核轉(zhuǎn)錄因子Gli1的效應(yīng)miRNAs的鑒定
　　目的:應(yīng)用染色體免疫共沉淀反應(yīng)聯(lián)合熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(ChIP-QPCR)的實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)HH-Gli1能與證候選效應(yīng)miRNAs的啟動(dòng)子序列結(jié)合;并構(gòu)建Gli1過(guò)表達(dá)載體，驗(yàn)證Gli1高表達(dá)時(shí)相應(yīng)候選效應(yīng)miRNAs也高表達(dá)，從而進(jìn)一步證實(shí)候選效應(yīng)miRNAs是Gli1的直接效應(yīng)miRNAs。
　　方法:構(gòu)建Gli1過(guò)表

5、達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SW1990胰腺癌細(xì)胞，以此作為實(shí)驗(yàn)組，SW1990細(xì)胞為對(duì)照組，展開(kāi)ChIP-QPCR實(shí)驗(yàn)，其中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)又分為實(shí)驗(yàn)組（應(yīng)用抗Gli1抗體）、陰參組(兔 IgG)、陽(yáng)參組（應(yīng)用抗RNA聚合酶Ⅱ抗體）和input組，經(jīng)細(xì)胞裂解、超聲破碎、抗體孵育、洗脫純化后得到的DNA片段進(jìn)行PCR檢測(cè)，最終結(jié)果均以input的百分比表示，各自比較Gli1組與陰參組之間的差異，并將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的Gli1組進(jìn)行比較，得到兩組之間樣

6、品比值;構(gòu)建Gli1過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染SW1990胰腺癌細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照，檢測(cè)相應(yīng)效應(yīng)miRNAs表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.構(gòu)建Gli1過(guò)表達(dá)載體成功。
　　2.轉(zhuǎn)染Gli1基因成功的SW1990胰腺癌細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）與SW1990細(xì)胞（對(duì)照組）分別進(jìn)行ChIP-QPCR，最終對(duì)照組的3個(gè)效應(yīng)miRNAs（即miR-301a，miR-29b-1，miR-1228）的Gli1組與IgG組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

7、P＞0.05)，而實(shí)驗(yàn)組的3個(gè)效應(yīng)miRNAs(即miR-301a，miR-29b-1,miR-1228)的Gli1組與IgG組相比，有差異且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　3.三組效應(yīng)miRNAs(miR-301a，miR-29b-1，miR-1228)的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的Gli1組比較，實(shí)驗(yàn)組均有不同水平的升高，分別是對(duì)照組的3倍，2.7倍和2倍。
　　4.轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Gli1載體的SW1990細(xì)胞中提取總RNA，檢測(cè)