Hedgehog-Gli1信號通路在胃癌干樣細胞生物學行為中的作用及機制研究.pdf

1、背景:胃癌是危及我國居民生命的最常見惡性腫瘤之一。近年來隨著早診技術提高和以手術為主的綜合治療技術的發(fā)展使得胃癌患者預后得到很大改善。但是胃癌的五年生存率仍然不足30％。侵襲和轉移以及耐藥依然是治療失敗的主要原因。腫瘤干細胞具有自我分化、自我增殖、耐放化療等特性，被認為是腫瘤復發(fā)轉移的根源。目前多項研究表明Hedgehog-Gli1信號通路在多種不同的腫瘤干細胞的生物學特性的維持中具有重要的作用，其中Gli1是該信號通路的節(jié)點基因。為了

2、改善胃癌患者預后、提高放化療及基因治療的效果，設計了該實驗對胃癌干樣細胞的增殖、侵襲轉移、耐藥等機制進行深入研究，期待為臨床開發(fā)針對于臨床耐藥、易于轉移的腫瘤細胞的治療方法提供一些線索和思路。
　　目的:研究Gli1在胃癌干樣細胞中的表達規(guī)律，發(fā)現(xiàn)其與胃癌干樣細胞的增殖、侵襲、耐藥的關系，并探討其與其他信號通路的相互調節(jié)，探討以慢病毒載體為基礎的基因治療在胃癌領域發(fā)展的價值。
　　方法:
　　1、培養(yǎng)鑒定胃癌干樣細胞(

3、cancer stem cell-like cancer cells)，通過懸浮球培養(yǎng)、增殖實驗、體內成瘤實驗，確定其腫瘤干細胞(cancer stemcells)標志物，分離出富集腫瘤干細胞的胃癌側群細胞。
　　2、構建慢病毒干涉載體sh-Gli1-RNA，下調Gli1在胃癌干樣細胞中的表達，通過qPCR和Western-blot檢測Gli1表達的改變，驗證干涉載體下調細胞中Gli1表達的效果。
　　3、下調Gli1前后:

4、通過克隆形成實驗、CCK8實驗、Transwell實驗檢測胃癌干樣細胞中的增殖能力、遷徙能力的影響、化療耐受性的變化;通過流式凋亡檢測分析SMO拮抗劑cyclopamine與sh-Gli1-RNA對胃癌干樣細胞凋亡的影響有無差距;通過小鼠成瘤實驗檢測下調Gli1對胃癌干樣細胞體內成瘤能力的影響。
　　4、上調ZNRF3表達:通過qPCR和Western-blot檢測ZNRF3與Gli1的變化關系;通過Annexin/PI檢測其對胃

5、癌細胞及黏膜細胞增殖凋亡的影響;通過qPCR和Western-blot檢測其與Bcl-2、Ki-67等凋亡、增殖蛋白的相互調節(jié)關系;在原代胃癌細胞中檢測ZNRF3與Gli1表達。
　　結果:
　　1、培養(yǎng)鑒定胃癌干樣細胞，懸浮球培養(yǎng)、增殖實驗、體內成瘤實驗，確定CD44+CD54+是胃癌干細胞的標志物，CD44+CD54+的胃癌細胞是富集胃癌干細胞的側群細胞。
　　2、下調Gli1在胃癌干樣細胞中的表達后，懸浮球實驗、

6、qPCR和Western-blot檢測結果均顯示Gli1表達下降，證明轉染效率佳。
　　3、下調Gli1可以引起以下變化:通過克隆形成率實驗、CCK8實驗結果、Transwe1l實驗檢測、小鼠成瘤實驗顯示胃癌干樣細胞的增殖能力、遷徙能力、化療耐藥、體內成瘤能力均降低。流式凋亡檢測分析顯示sh-Gli1-RNA比cyclopamine對胃癌干樣細胞凋亡的降低作用更顯著。
　　4、調高ZNRF3表達后:qPCR和Western檢

7、測發(fā)現(xiàn)Gli1的變化下降;Annexin/PI檢測發(fā)現(xiàn)上調ZNRF3可增加胃癌細胞及黏膜細胞增殖凋亡，對胃癌細胞影響更為顯著;qPCR和Western檢測發(fā)現(xiàn)上調ZNRF3可以降低Bcl-2、Ki-67表達;在原代胃癌細胞中檢測ZNRF3與Gli1表達負相關。
　　結論:
　　1、Gli1參與調控胃癌干樣細胞的自我增殖、耐藥、體內成瘤。
　　2、下調Gli1的表達可以有效地抑制胃癌干樣細胞的增殖、侵襲能力、化療耐藥性、

8、動物體內成瘤能力。
　　3、Hedgehog信號通路還能受抑癌基因ZNRF3的調控，上調ZNRF3可以下調Gli1的表達，進而增加胃癌干樣細胞的凋亡。
　　4、Gli1在胃癌干樣細胞的增殖、侵襲、耐藥和體內成瘤能力方面起到重要的作用。因此，Gli1可以成為治療的靶點。Sh-Gli1-RNA慢病毒載體是一種值得開發(fā)的治療胃癌的手段。
　　5、ZNRF3可以降低Gli1的表達，我們推測ZNRF3可能通過改變Gli1的表達進