桂皮醛通過PI3K-AKT信號通路對于腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制.pdf

1、目的:
　　觀察桂皮醛對腸癌細(xì)胞增殖、侵襲與黏附、細(xì)胞凋亡的影響及與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系。
　　方法:
　　①M(fèi)TT法檢測不同濃度桂皮醛(0，20，40，60，80μg/ml)作用于人腸癌細(xì)胞(Lovo、SW480、HCT116)12、24、48h后對細(xì)胞增殖能力的影響;
　?、诟鶕?jù)第一部分實(shí)驗(yàn)最終采用（0，20，40，80μg/ml的濃度及給藥后24小時(shí)觀察的方式進(jìn)行第二部分實(shí)驗(yàn)。使用基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)及T

2、ranswell小室實(shí)驗(yàn)檢測桂皮醛對細(xì)胞侵襲及粘附能力的影響;Western blot法檢測檢測侵襲粘附相關(guān)蛋白(E-cadherin、MMP-2、MMP-9)的表達(dá)量。
　?、跦oechst33258熒光染色檢測桂皮醛對細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率;Western blot法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bcl-2、Bax、PARP、cleaved-PARP)的表達(dá)量。
　　④進(jìn)一步探討桂皮醛對于PI3K/Akt

3、通路的影響，使用40μg/ml的中等劑量處理三種細(xì)胞株24h后Western blot法檢測PI3K，p-PI3K，Akt及p-Akt的表達(dá)量。為明確桂皮醛對于該通路的阻斷效果及阻斷位點(diǎn)，使用10 ng/mL的IGF-I對細(xì)胞株預(yù)處理2h（激動(dòng)該通路作為陰性參照組），LY294002+2 hIGF-I（LY294002阻斷作用及位點(diǎn)明確，作為陽性參照組）空白組及40μg/ml桂皮醛+2 hIGF-I（實(shí)驗(yàn)組）。使用Western blo

4、t法檢測以上各組PI3K、Akt和p-Akt p-PI3K的表達(dá)量明確桂皮醛的阻斷效果及阻滯位點(diǎn)。
　?、萏接懝鹌とδc癌細(xì)胞凋亡的影響與PI3K/Akt通路之間的關(guān)系，根據(jù)第四部分實(shí)驗(yàn)，分為五個(gè)實(shí)驗(yàn)組，采取不同的組合方式，用Western blot法檢測胞凋亡相關(guān)基因（Bcl-2、Bax、PARP、cleaved-PARP）的表達(dá)量表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　不同劑量的桂皮醛在對三種分化及侵襲能力不同的細(xì)胞給藥12

5、h、24、48小時(shí)后，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)桂皮醛對這三種腸癌細(xì)胞有明顯抑制增殖的作用，這種抑制作用成濃度和時(shí)間依賴性;桂皮醛以不同濃度對三株腸癌細(xì)胞給藥24h后發(fā)現(xiàn)，與對照組相相比，其能顯著抑制腸癌細(xì)胞的侵襲能力，鏡下顯示侵襲過去的細(xì)胞數(shù)目均明顯低于對照組，且呈濃度依賴關(guān)系，基質(zhì)粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和MTT結(jié)果一致桂皮醛對腸癌細(xì)胞的粘附抑制作用呈時(shí)間和濃度依賴關(guān)系，對侵襲率的抑制亦呈濃度依賴關(guān)系，為進(jìn)一步明確抑制粘附及侵襲機(jī)制，West

6、ern Bolt檢測了粘附侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示上皮粘蛋白(E-cadherin)E-cad的表達(dá)呈與濃度成正相關(guān)性，而基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)則呈負(fù)相關(guān)性。Hoechst33258熒光染色檢測桂皮醛對細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)的影響，觀察到在細(xì)胞核凋亡時(shí)出現(xiàn)的核固縮及碎裂，為了量化桂皮醛的凋亡率我們使用AnnexinⅤ/PI雙染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示桂皮醛能誘導(dǎo)三種腸癌細(xì)胞的凋亡且與濃度呈正相關(guān)，Western Bolt實(shí)驗(yàn)證明桂

7、皮醛能上調(diào)Bax、cleaved-PARP的表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、PARP的活性，且這種表達(dá)呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中等劑量的桂皮醛對于PI3K/Akt通路即有明顯的抑制作用，p-PI3K, p-Akt的表達(dá)量均減少，其中p-AKT/AKT的比值明顯降低。為明確桂皮醛對該通路的抑制作用及阻滯位點(diǎn)分別使用通路的激動(dòng)劑及抑制劑做為陰性參照和陽性參照，實(shí)驗(yàn)表明桂皮醛對該通路有明確的阻滯作用，即可阻滯PI3K的活化亦可阻滯Akt的活化，

8、其對Akt的阻斷作用較LY294002相似。探討桂皮醛對腸癌細(xì)胞凋亡的影響與PI3K/Akt通路之間的關(guān)系，第五部分實(shí)驗(yàn)表明IGF-1誘導(dǎo)的抗凋亡能明顯的被桂皮醛抑制，且作用與LY294002相似。綜上所述，桂皮醛可以下調(diào)PI3K/Akt依賴的轉(zhuǎn)錄活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　桂皮醛能有效抑制人腸癌細(xì)胞的增殖。桂皮醛對其侵襲轉(zhuǎn)移具有抑制作用，其機(jī)制可能與其上調(diào)E-cad蛋白的表達(dá)，下調(diào)MMP-2、MM