前列腺癌miR-23b的表達(dá)與調(diào)控機(jī)制的初步研究.pdf

1、背景：
　　 前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康。我國是世界上最大的發(fā)展中國家，隨著老年人口的增多、飲食結(jié)構(gòu)的改變及腫瘤診斷技術(shù)的提高，前列腺癌發(fā)病率日趨上升，如何治療前列腺癌顯得極為迫切和重要。
　　 直腸指檢、影像學(xué)與組織檢查是前列腺癌診斷的主要方法，前列腺的組織形態(tài)與生物學(xué)行為復(fù)雜，這些檢查對早期診斷前列腺癌比較困難。分子生物學(xué)方法證明多種抑癌基因和癌基因的共同作用導(dǎo)致前列腺癌發(fā)生與發(fā)

2、展，目前從蛋白與基因水平可以實(shí)現(xiàn)前列腺癌檢測，使用免疫組化、RT-PCR與芯片等方法以分析和比較PCa細(xì)胞、正常細(xì)胞和組織基因產(chǎn)物，目前蛋白組學(xué)的表達(dá)研究已鑒定出一系列用于PCa診斷與提供預(yù)后評估的生物標(biāo)記。前列腺特異抗原(PSA)已經(jīng)成為前列腺癌腫瘤標(biāo)志物廣泛在臨床應(yīng)用，但其存在特異與敏感的有限性，使其在臨床仍存在爭議。
　　 前列腺特異抗原(PSA)是當(dāng)前前列腺增生與前列腺癌臨床診斷的主要鑒別與診斷手段，前列腺癌的病理分級應(yīng)

3、用Gleason評分來評定，腫瘤惡性程度以評測前列腺癌細(xì)胞的惡性分級，TNM分期用來進(jìn)行前列腺癌的臨床分期。前列腺炎、前列腺增生、乳腺癌等疾病都會(huì)引起血漿PSA升高。PSA值為4～10ng/ml時(shí)，區(qū)別BPH與PCa困難。Gleason評分易受病理醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)與主觀看法的影響，對前列腺癌的惡性程度客觀準(zhǔn)確判定困難。臨床需要比PSA更加可靠的指標(biāo)，需要比Gleason評分和腫瘤惡性程度的分級更客觀的病理分級指標(biāo)。當(dāng)前的前列腺癌治療方式仍以手術(shù)

4、與術(shù)后輔助放療和化療為主，但其治療效果仍不夠理想，影響生存率與致死的主要原因是前列腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移（特別是骨轉(zhuǎn)移）。
　　 microRNA(miRNA)是一組保守的、非編碼的、長約22nt的非編碼單鏈RNA分子，分布在病毒、植物至高等哺乳動(dòng)物等生物之中。目前，miRNA的已知功能是在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，microRNA主要作為基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控因子，通過抑制靶基因翻譯以起到調(diào)控作用。許多研究顯示，miRNA在細(xì)胞的分化、增殖

5、、凋亡、個(gè)體發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生與發(fā)展等方面有重要作用。microRNA為前列腺癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供了新的工具。研究表明microRNAs不但調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡，還參與調(diào)控腫瘤的細(xì)胞轉(zhuǎn)移。有相當(dāng)數(shù)量的microRNAs經(jīng)研究證實(shí)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，如miR-10b、miR-21、miR-335、miR-373與miR-520c等參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移機(jī)制;miR-21與miR-224參與調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;m

6、iR-21也可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移;miR-7、miR-10a、miR-125b、miR-222和miR-452等參與調(diào)控膀胱上皮癌的轉(zhuǎn)移機(jī)制。miRNAs發(fā)揮調(diào)控作用是一種miRNA可以調(diào)控多個(gè)靶基因，一個(gè)靶基因可以被多個(gè)miRNAs所調(diào)控，其調(diào)控方式可以通過對其靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)節(jié)。當(dāng)miRNA與其靶向mRNA完全或幾乎完全互補(bǔ)時(shí)，可引起目的mRNA被降解，當(dāng)miRNA與靶向mRNA是不完全互補(bǔ)時(shí)，則是負(fù)調(diào)控翻譯過程，阻

7、礙蛋白質(zhì)的翻譯。研究表明，腫瘤組織的miRNAs表達(dá)譜與腫瘤的類型相關(guān)，不同種類的腫瘤具有不同的miRNAs表達(dá)譜，因此miRNA可作為腫瘤診斷標(biāo)志物，而且可用于腫瘤的治療和預(yù)后判斷。
　　 惡性腫瘤細(xì)胞的糖酵解途徑越來越受到重視，惡性腫瘤細(xì)胞的糖酵解途徑產(chǎn)能明顯低于線粒體的氧化磷酸化，但惡性腫瘤細(xì)胞可以從活躍的糖酵解代謝中受益，這利于腫瘤細(xì)胞的生長，有重要的病理生理意義。針對腫瘤代謝路徑的深入研究為惡性腫瘤的靶向治療提供了極具

8、潛在價(jià)值的研究方向。
　　 MiR-23b是一個(gè)參與調(diào)節(jié)多個(gè)信號通路的多功能miRNA，作用涉及分化、增殖、凋亡、細(xì)胞粘附等多個(gè)方面，而且關(guān)于其功能及作用機(jī)制的研究仍在不斷擴(kuò)展。
　　 MiR-23b是靶向谷氨酰胺酶的基因，靶蛋白是線粒體的谷氨酰胺酶，其是三竣酸循環(huán)生成ATP的關(guān)鍵酶之一。抑制miR-23b可以間接提高谷氨酰胺酶基因mRNA的翻譯，產(chǎn)生大量的目標(biāo)蛋白為線粒體的谷氨酰胺酶，該酶催化谷氨酰胺分解成為谷氨酸，通

9、過三竣酸循環(huán)生成ATP來滿足腫瘤細(xì)胞的能量需求。miR-23b證實(shí)在腫瘤細(xì)胞的能量代謝中有著重要作用。
　　 PRDX蛋白質(zhì)是細(xì)胞抗氧化防御的重要調(diào)節(jié)因子，被證實(shí)參與惡變和治療抵抗。多功能PRDXs被證明與前列腺癌相關(guān)，研究表明前列腺癌的細(xì)胞株中有共同表達(dá)的蛋白水平的PRDXs。穩(wěn)定反義轉(zhuǎn)染允許部分選擇性抑制PRDX1、2或3而不是部分抑制4時(shí)，前列腺癌細(xì)胞對過氧化氫或有機(jī)過氧化物變得更加敏感。升高表達(dá)的PRDX1提高雄激素受體

10、(AR)的轉(zhuǎn)錄，在PCa刺激缺氧/復(fù)氧配體、受體的敏感性方面發(fā)揮了重要作用，因此為前列腺癌細(xì)胞在不利的微環(huán)境中提供生存優(yōu)勢。PRDX1一直被視為是在阻止雄激素依賴性前列腺癌轉(zhuǎn)化為雄激素難治型的治療目標(biāo)。此外，在前列腺癌中，PRDX3和PRDX4也是差異表達(dá)，PRDX3蛋白在前列腺癌比相鄰的良性前列腺組織上調(diào)。
　　 PRDX3是唯一定位在線粒體內(nèi)的PRDX家族成員，主要作用為抗氧化、保持細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的穩(wěn)態(tài)。線粒體是多數(shù)

11、真核細(xì)胞產(chǎn)生ROS的主要部位，ROS在細(xì)胞增殖、分化與凋亡等重要細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。正常數(shù)量ROS在細(xì)胞的生理活動(dòng)中有重要的作用，而過多的ROS能攻擊細(xì)胞內(nèi)的大分子，產(chǎn)生DNA損傷、蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過氧化等變化導(dǎo)致細(xì)胞損傷，促使致癌物質(zhì)產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤，但ROS同時(shí)具有殺傷癌細(xì)胞與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力，推測細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)和腫瘤形成有密切關(guān)系。PRDX3是凋節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS水平以及具有影響細(xì)胞凋亡功能的基因，同時(shí)又是c-myc癌基因

12、的靶基因。在c-myc癌基因產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的過程中必需PRDX3的參與，這也說明PRDX3可能與腫瘤的形成相關(guān)。
　　 本文通過對miR-23b在前列腺癌診斷中的表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步的分析，利用熒光定量RT-PCR技術(shù)對miR-23b在前列腺癌中的表達(dá)進(jìn)行檢測，并分析其臨床意義，并就其在前列腺癌細(xì)胞能量中的作用及其機(jī)制進(jìn)行初步的研究。
　　 第一章，前列腺癌中miR-23b的表達(dá)與意義
　　 目的:
　　

13、 miRNA在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、個(gè)體發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展等方面有重要的作用。我們的miRNA芯片檢測發(fā)現(xiàn)前列腺癌組織miR-23b表達(dá)下調(diào)，但由于miRNA片段過小及樣本間的差異，因此芯片雜交結(jié)果可能存在一定的假陽性，重現(xiàn)性與準(zhǔn)確性比較差，一般多用于初篩，但需要Northernblot或?qū)崟r(shí)定量PCR等實(shí)驗(yàn)方法來驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，并通過擴(kuò)大樣本量，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，同時(shí)進(jìn)一步探

14、討特定miR-23b表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面所起的作用;并觀察其在前列腺癌有無特異性表達(dá);
　　 方法:
　　 1.取實(shí)驗(yàn)室液氮凍存的前列腺癌及配對的正常組織進(jìn)行HE染色，確認(rèn)病理情況后;采用Agilent人miRNA寡核苷酸基因芯片，對前列腺癌組織及配對正常組織進(jìn)行檢測，篩選前列腺癌差異表達(dá)的miRNAs以及觀察miR-23b的表達(dá)。
　　 2.選擇miR-23b，在前列腺癌及配對正常組織

15、中用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證，觀察表達(dá)狀況。
　　 3.選擇miR-23b，在前列腺癌及其配對的正常組織中用原位雜交進(jìn)行驗(yàn)證，并觀察其與患者年齡、腫瘤大小、PSA、Gleason評分和病理分期等的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.通過對液氮凍存的前列腺癌及配對正常組織的HE染色，確認(rèn)病理狀況;進(jìn)行miRNAs芯片檢測，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌組織與配對的正常組織中表達(dá)差異的miRNAs，miR-23b在前列腺癌組織中比相鄰

16、的良性前列腺組織中明顯下調(diào)。
　　 2.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)miR-23b在前列腺癌組織中的表達(dá)水平比相鄰的良性前列腺組織降低(P＜0.01)，表達(dá)情況與芯片一致。
　　 3.對前列腺癌及配對正常組織中用原位雜交進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)miR-23b在前列腺癌組織中的表達(dá)水平比相鄰的良性前列腺組織(P＜0.01)降低，miR-23b在轉(zhuǎn)移前列腺癌組織比非轉(zhuǎn)移前列腺癌的表達(dá)降低(P＜0.001)，miR-23b表達(dá)降低與

17、Gleason評分升高(P=0.002)和較高的病理分期(P=0.022)相關(guān)，無論是單因素和多因素分析表明，miR-23b的下調(diào)是一個(gè)提示是生化復(fù)發(fā)不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素。
　　 結(jié)論:
　　 1.前列腺癌有其獨(dú)特的miRNA表達(dá)譜，miR-23b在前列腺癌組織中明顯下調(diào);
　　 2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證miR-23b驗(yàn)證的差異表達(dá)情況與芯片一致;
　　 3.miR-23b可能作為前列腺癌潛在的分子標(biāo)

18、志物，miR-23b的下調(diào)是一個(gè)提示生化復(fù)發(fā)不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因素。
　　 第二章，miR-23b調(diào)控PRDX3研究
　　 目的:
　　 miR-23b是靶向谷氨酰胺酶基因，靶蛋白是線粒體的谷氨酰胺酶，是三竣酸循環(huán)生成ATP的關(guān)鍵酶之一。癌基因轉(zhuǎn)錄因子c-myc對microRNAs具有調(diào)控作用，通過抑制miR-23a和miR-23b的轉(zhuǎn)錄，間接地提高谷氨酰胺酶基因mRNA的翻譯，導(dǎo)致大量的目標(biāo)蛋白線粒體谷氨酰胺酶

19、的表達(dá)，進(jìn)一步催化谷氨酰胺分解為谷氨酸，通過三竣酸循環(huán)產(chǎn)生ATP供應(yīng)腫瘤細(xì)胞的能量需求，c-Myc基因通過調(diào)控miRNA在谷氨酰胺代謝、能量與活性氧的動(dòng)態(tài)平衡等之間有重要作用。過氧化物酶Ⅲ(PRDX3)在人類前列腺癌中過度表達(dá)，也是c-myc癌基因的靶基因。在c-myc癌基因表達(dá)和產(chǎn)生促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的過程中必需PRDX3的參與，說明PRDX3可能與腫瘤的形成相關(guān)。我們使用TargetScan5.1預(yù)測miR-23b的靶目標(biāo)并結(jié)合差異

20、熒光凝膠蛋白組學(xué)(DIGE)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中符合“miRNA表達(dá)下調(diào)，其靶基因表達(dá)將上升”調(diào)節(jié)規(guī)律的靶基因PRDX3，因此我們擬進(jìn)一步證明miR-23b對PRDX3的調(diào)控關(guān)系，同時(shí)研究miR-23b、PRDX3在前列腺癌中的臨床特點(diǎn)，及兩者參與缺氧脅迫中的作用。
　　 方法:
　　 1.通過TargetScan5.1的microRNA目標(biāo)生物信息學(xué)預(yù)測系統(tǒng)，結(jié)合miRNA芯片表達(dá)數(shù)據(jù)和DIGE蛋白組學(xué)結(jié)果，篩選獲得m

21、iR-23b調(diào)節(jié)的靶基因PRDX3。
　　 2.用石蠟切片，采用免疫組化研究PRDX3前列腺癌組織中的表達(dá)，對免疫組化結(jié)果進(jìn)行評分，統(tǒng)計(jì)分析PRDX3的表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小、PSA、Gleason評分和病理分期等的關(guān)系。
　　 3.結(jié)合兩基因臨床研究結(jié)果，分析PRDX3與miR-23b兩基因的臨床相關(guān)性。
　　 4.構(gòu)建miR-23b過表達(dá)載體、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株篩選、蛋白提取和WesternBlot檢測，

22、驗(yàn)證miR-23b對PRDX3的調(diào)節(jié)功能。
　　 結(jié)果:
　　 1.PRDX3在前列腺癌組織中的表達(dá)增加。
　　 2.TargetScan5.1的microRNA目標(biāo)生物信息學(xué)預(yù)測系統(tǒng)分析預(yù)測PRDX3的3個(gè)miRNAs潛在目標(biāo)靶:miR-23a，miR-23b和miR-383。
　　 3.miR-23b的前列腺癌組織中的表達(dá)水平分別比相鄰的良性前列腺組織(P＜0.01)降低，而PRDX3在前列腺痛組織中