前列腺癌血清miRNAs表達譜的檢測和miR-101靶向EZH2調控作用的初步研究.pdf

1、前列腺癌（prostate cancer，PCa）是男性最常見的泌尿系惡性腫瘤之一。目前主要的治療方法有：根治性手術治療和內分泌治療、放射治療及化療等。根治術后局部復發(fā)或遠處轉移及許多無手術機會的患者，常選用內分泌治療。接受內分泌治療的患者，大多數(shù)起初有效，但幾乎都將逐漸發(fā)展為激素非依賴性前列腺癌或激素難治性前列腺癌，激素治療將不再有效。因此，揭示前列腺癌進展中的分子機制已成為國內外研究的熱點。微小RNA（microRNA，miRNA，

2、miR）是一類長度約21～25nt的非編碼RNA，它通過影響mRNA的翻譯和穩(wěn)定性，在轉錄后水平發(fā)揮靶基因內源性抑制因子的作用。在過去的幾年中，各種人類腫瘤的miRNA表達譜分析提示許多miRNA發(fā)揮著抑癌基因的作用。相對于正常組織而言，miR-101在多種惡性腫瘤中表達下調，目前認為miR-101可能作為一個惡性腫瘤治療性干預的潛在靶點。
　　本研究中我們首先檢測不同臨床階段前列腺癌患者的血清和前列腺增生患者的血清中差異性的mi

3、RNAs表達譜，篩選與前列腺癌相關的miRNA。探索血清中miR-101能否有利于前列腺癌的診斷和評估其惡性程度。此外，我們利用人工合成的miR-101模擬物（miR-101 mimics）轉染前列腺癌PC-3細胞，從而分析在前列腺癌中miR-101與EZH2的靶向調節(jié)效應和作用機制。
　　本研究分兩個部分：
　　第一部分，前列腺癌患者血清miRNAs表達譜的研究
　　目的：研究不同臨床階段前列腺癌患者的血清和前列腺增

4、生患者的血清中差異性表達的miRNAs譜，篩選與前列腺癌相關的miRNA。
　　方法：采用 miRNA芯片技術(miRNA microarray)篩選激素依賴性前列腺癌（androgen-dependent prostate cancer, ADPC）、激素非依賴性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer, AIPC）和前列腺增生（benign prostatic hyperplasia,

5、 BPH）患者血清中差異表達的miRNA，并對數(shù)據(jù)庫中獲取的表達差異的miRNA所調控的靶基因功能進行GO分析和pathway分析。
　　結果：對3例ADPC、3例AIPC和3例前列腺增生患者的血清進行了miRNA芯片分析，共篩選出31個差異表達的miRNA；ADPC組與BPH組血清相比，有8個miRNA表達存在差異，其中有7個 miRNA表達上調（miR-181a-2、miR-29a、miR-423-5p、miR-424、miR

6、-1184、miR-671-3p、miR-548b-3p），1個miRNA表達下調（let-7b）（P<0.001）；AIPC組與 BPH組血清相比，有9個 miRNA表達上調（miR-181a-2、miR-3664、miR-519e、miR-144、miR-603、miR-187、miR-491-3p、miR-BART20-5p、miR-3139），有6個miRNA表達下調（miRPlus-A1073、miR-542-3p、miR-6

7、60、miR-134、miR-15b、miR-H4-3p）（P<0.001）；其中 miR-181a-2在 ADPC組和AIPC組中均明顯高表達；AIPC組與 ADPC組血清相比，分別有4個 miRNA表達上調和下調，其中上調的 miRNA為 miR-BART16、miR-3142、miR-491-3p、miR-214；下調的miRNA為miR-369-3p、miR-371-3p、miR-495、miR-671-3p（P<0.001）。

8、通過數(shù)據(jù)庫分析得出異常表達miRNA調控的靶基因并進行Gene Ontology（GO）和Pathway的顯著性分析，得到了相應的顯著性的GOs和和Pathway。
　　結論：miRNA可能參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展和雄激素非依賴性的轉變，血清中差異性表達的 miRNA可能成為潛在的前列腺癌診斷和治療的靶點，其中miR-181a-2可能與前列腺癌的發(fā)生發(fā)展有關。前列腺癌血清中未能檢測到 miR-101的差異表達，這證實血清和組織中m

9、iRNA的相關性仍存在爭議。
　　第二部分，miR-101和EZH2在前列腺癌中的表達以及miR-101靶向EZH2對PC3細胞生物學行為的影響
　　目的：通過檢測前列腺癌及正常前列腺上皮細胞中 miR-101和 EZH2的表達水平，利用合成的miR-101 mimics轉染前列腺癌PC-3細胞并觀察對其生物學行為的影響，從而分析在前列腺癌中miR-101與EZH2的靶向調節(jié)效應和作用機制。
　　方法：運用實時定量PC

10、R（Real-time quantitative PCR）檢測前列腺癌PC-3細胞、LNCaP細胞和前列腺正常上皮RWPE-1細胞中miR-101和EZH2 mRNA的表達；應用Western-Blot蛋白印記法檢測上述細胞中EZH2的蛋白表達水平；PC-3細胞分為三組：不轉染的空白對照組（B組）；轉染NC的陰性對照組（NC組）；轉染miR-101 mimics的實驗組（miR-101組）。通過miR-101mimics轉染前列腺癌PC

11、-3細胞并上調細胞中miR-101的表達，Real-time qPCR和Western blot檢測細胞中EZH2表達水平的變化；應用噻唑藍比色法（MTT法）測定細胞增殖情況、流式細胞儀檢測細胞周期；Annexin V/PI雙染色法測量細胞凋亡率；劃痕實驗檢測細胞遷移能力；Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲力。對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。
　　結果：（1）miR-101在PC-3細胞和LNCaP細胞中的表達明顯低于RWPE-1細

12、胞，miR-101在前列腺各細胞株間的表達具有顯著差異性（P<0.05）。（2） EZH2 mRNA在PC-3細胞和LNCaP細胞中的表達明顯高于RWPE-1細胞，EZH2蛋白在PC-3細胞和LNCaP細胞中的表達也明顯高于RWPE-1細胞，EZH2mRNA和蛋白在前列腺各細胞株間的表達具有顯著差異性（P均<0.05）。miR-101的表達量與EZH2表達量呈負相關趨勢（P<0.05）。（3）miR-101 mimics轉染PC-3細胞

13、后，細胞中的miR-101表達上調（P<0.05），而EZH2 mRNA和蛋白表達水平也明顯降低（P<0.05）。（4） MTT法檢測結果顯示：轉染后48、72、96小時miR-101組細胞增殖明顯低于B組和NC組（P<0.05），兩對照組無顯著性差異（P>0.05）。（5）流式細胞儀測定結果顯示：轉染后48小時，miR-101組發(fā)生了G0/G1期阻滯（P<0.05），B組和NC組細胞周期分布無顯著差異（P>0.05）。（6）細胞凋亡率

14、檢測結果顯示：轉染后48小時，B組、NC組及miR-101組PC-3細胞凋亡率分別為：2.53±0.36%、2.71±0.42%、9.84±0.83%，miR-101組凋亡率明顯高于兩對照組（P<0.01）。（7）劃痕實驗檢測結果顯示：miR-101組細胞遷移能力明顯低于對照組（P<0.01）；兩對照組無顯著性差異（P>0.05）。（8）Transwell侵襲實驗結果顯示：miR-101組穿過Matrigel凝膠的細胞數(shù)顯著少于B組和N

15、C組（P<0.01），兩對照組間無顯著性差異（P>0.05）。
　　結論：（1）前列腺癌細胞中miR-101表達量較正常前列腺細胞降低，而EZH2的表達量則上調；提示異常表達的miR-101和EZH2均參與了前列腺癌的發(fā)生發(fā)展；兩者表達呈負相關提示EZH2可能是miR-101負向調控的靶基因之一。（2）miR-101在AIPC細胞中表達水平低于ADPC細胞，EZH2的表達則相反；提示兩者可能在激素非依賴性轉化過程中起著一定的作用。