miR-146b-5p生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討MicroRNA-146b-5p（miR-146b-5p）的生物學(xué)性能，檢測其對小鼠骨髓來源樹突狀細(xì)胞（DC）成熟的影響，以及對小鼠骨片來源間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）成脂分化能力的影響。
　　方法：
　?。?）從C57BL/6小鼠骨髓中分離CD11b+單核細(xì)胞，并對其進(jìn)行5-7天的誘導(dǎo)分化，使其成為未成熟 DC（iDC）和成熟 DC（mDC），采用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測其細(xì)胞表型。對單核細(xì)胞及不同時(shí)期的 DC進(jìn)行 Micr

2、oRNA芯片分析，依據(jù)芯片結(jié)果選擇在DC成熟過程中高表達(dá)的miRNAs，并通過熒光定量PCR（q-PCR）進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn) miR-146b-5p在分化過程中高表達(dá)且變化顯著。進(jìn)一步，將miR-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染小鼠骨髓CD11b+單核細(xì)胞，吞噬實(shí)驗(yàn)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）檢測miR-146b-5p對DC成熟的影響。
　?。?）從C57BL/6小鼠骨實(shí)質(zhì)中分離培養(yǎng)MSC，并經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測鑒

3、定其表型。q-PCR檢測骨實(shí)質(zhì)來源的MSC在誘導(dǎo)成脂過程中，細(xì)胞內(nèi)miR-146b-5p表達(dá)水平的改變。將miR-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染MSC并檢測其成脂分化能力的改變。培養(yǎng)14d后，油紅O染色鑒定其成脂分化能力，并通過q-PCR檢測成脂分化因子C/EBPα和PPARγ的表達(dá)，Western Blot檢測PPARγ蛋白的表達(dá)，以闡述miR-146b-5p對小鼠骨實(shí)質(zhì)來源的MSC成脂分化能力的影響。

4、　　結(jié)果：
　?。?）我們采用免疫磁珠法成功分離出小鼠骨髓來源的 CD11b+單核細(xì)胞，并誘導(dǎo)成iDC和mDC。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，小鼠骨髓來源的iDC低表達(dá)CD80、CD86、CD11c、MHCⅡ，高表達(dá) CD11b；小鼠骨髓來源的 mDC高表達(dá) CD80、CD86、CD11c、MHCⅡ，低表達(dá)CD11b，符合iDC和mDC的表型特征。對芯片結(jié)果進(jìn)行比較篩查，發(fā)現(xiàn) miR-146b-5p、miR-21a-5p、miR-690

5、、miR-223-3p、miR-155-5p、miR-107-3p、miR-1224-5p和miR-5112等在單核細(xì)胞向DC發(fā)育成熟過程中表達(dá)量較高且差異顯著，經(jīng)由qPCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-146b-5p具有顯著改變。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小鼠骨髓來源的 CD11b+單核細(xì)胞在誘導(dǎo) DC成熟的過程中，miR-146b-5p的表達(dá)量隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加而降低（p＜0.01）。將 miR-146b-5p mimics或 inhibitors轉(zhuǎn)染小鼠

6、骨髓 CD11b+單核細(xì)胞，吞噬實(shí)驗(yàn)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測miR-146b-5p對DC成熟的調(diào)控作用，結(jié)果表明，miR-146b-5p缺失可導(dǎo)致單核細(xì)胞的吞噬能力顯著降低，表現(xiàn)為成熟DC表型。MLR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染mimics會降低DC對T細(xì)胞的刺激能力。
　　（2）成功分離出小鼠骨實(shí)質(zhì)來源的MSC，并符合MSC的典型特征，即細(xì)胞形態(tài)呈長梭形，高表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD29和 CD105，高表達(dá)干性表面標(biāo)志物Sca-1，不表

7、達(dá)內(nèi)皮表面標(biāo)志物CD31、不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志物CD34、CD11b、CD45和主要組織相容性復(fù)合體MHCⅡ以及CD140a。通過q-PCR檢測骨實(shí)質(zhì)來源的MSC在誘導(dǎo)成脂過程中miR-146b-5p的表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，miR-146b-5p的表達(dá)亦顯著增加，7d后趨于平穩(wěn)（p＜0.01）。將miR-146b-5p mimics或inhibitors轉(zhuǎn)染MSC，可有效改變細(xì)胞內(nèi)miR-146b-5p的表達(dá)。與對照組相

8、比，轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimics后細(xì)胞表達(dá)miR-146b-5p顯著上調(diào)（p＜0.001），轉(zhuǎn)染miR-146b-5p inhibitors后細(xì)胞表達(dá)miR-146b-5p顯著下調(diào)（p＜0.01）。油紅O染色結(jié)果表明，誘導(dǎo)14d后，過表達(dá)miR-146b-5p可顯著提高分化細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)目和成脂比例；而抑制miR-146b-5p后可有效阻斷誘導(dǎo)成脂過程，脂滴減少，脂肪細(xì)胞明顯減少。q-PCR檢測結(jié)果表明，與自分化組相比，轉(zhuǎn)染m

9、iR-146b-5p mimics后細(xì)胞表達(dá)C/EBPα和PPARγ顯著上調(diào)（p＜0.01），轉(zhuǎn)染miR-146b-5p inhibitors后細(xì)胞表達(dá)C/EBPα和PPARγ顯著下調(diào)（p＜0.05）。Western Blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-146b-5p mimics后細(xì)胞表達(dá)PPARγ顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)染miR-146b-5p inhibitors后細(xì)胞表達(dá)PPARγ顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：miR-146b-5p inhib