核酸的生物學功能

1、第17章 　核酸技術(shù),（一）重組DNA技術(shù)的基礎 （二）重組DNA技術(shù)的基本操作過程 （三）重組DNA技術(shù)的應用,,（一）重組DNA技術(shù)的基礎,重組DNA技術(shù)的定義,在體外，將一種外源DNA和載體DNA重新組合連接，形成雜交DNA，然后將其轉(zhuǎn)入宿主細胞，最終使外源DNA在宿主細胞中隨著宿主細胞的繁殖而增殖和表達,從而改變生物原有遺傳性狀的過程，稱為重組DNA技術(shù)。 它是按生物科學規(guī)律，在體外人為的改造基因，最終往往

2、使生物的遺傳性狀獲得改變，故又稱為“遺傳工程” ，亦即“基因工程” 。,1.重組DNA技術(shù)的基礎,(1) 重要的工具酶 (2) 載體,（1）重要的工具酶,它能夠識別、切割雙鏈DNA分子中的特定序列，這些特定序列多數(shù)為反向重復序列，一般長度是4、5或6bp。,① 限制性內(nèi)切酶,① 粘性末端 如 EcoR I: 5’ ---GAATTC

3、 CTTAAG---3’ ② 平齊末端 如 HaeIII: 5’ ---GGCC CCGG---3’,,,,,,,,,,② DNA連接酶,目前使用的連接酶有兩種： 大腸桿菌DNA連接酶 黏性末端連接； T4 連接酶 黏

4、性和平齊末端連接。,（2）載體,概 念 能將外源DNA帶入宿主細胞，進行復制擴增或最終使外源基因得以表達的自主 DNA，稱為載體（vector）。 分 類 ① 克隆載體 用于基因的復制、擴增、測序等； ② 表達載體 用于目的基因的表達。,（二）重組DNA技術(shù)的基本操作過程,1.目的基因的獲得 2.選擇和制備載體 3.將目的基因與載體進行切割連接

5、 4.將重組體導入受體細胞 5.陽性克隆的篩選和鑒定 6.DNA重組體的擴增、表達等研究,,,重組DNA技術(shù)的基本操作過程,1.目的基因的獲得,（1）提取DNA后，PCR體外特異擴增 （2）以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。 （3）化學合成基因 （4）限制性內(nèi)切酶從載體上切取 （5）構(gòu)建基因文庫，調(diào)取目的基因,2.載體的選擇和制備,原核生物常用的載體：質(zhì)粒和噬菌體； 真核生物

6、常用的載體：動物病毒、酵母； 穿梭載體：通常是指那些既能在真核細胞中繁殖又能在原核細胞中繁殖的載體。,,,目的基因與載體的酶切與連接,3.,4.重組DNA導入宿主細胞,大腸桿菌、酵母、真菌及各種真核細胞、受精卵細胞都可用于重組。,轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)染,--------,5.目的基因的篩選和鑒定,（1）遺傳學方法 （2）核酸雜交法 （3）PCR方法 （4）酶切鑒定,,（1）遺傳學方法,利用載體的特殊標記

7、如質(zhì)粒含有抗青霉素的基因，當含外源DNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可在含有青霉素的培養(yǎng)基中生長，而未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細菌在同樣的條件下不能生長。,（2）核酸雜交法,,菌落原位雜交,,,2,,,3,6,,2,,,,6,（3）多聚酶鏈式反應,20世紀80年代末發(fā)展起來的一種DNA特定片段體外快速合成擴增的方法，稱多聚酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）。PCR技術(shù)具有高度的靈敏性和特異性，能在極短的時間內(nèi)將目的基因擴增至數(shù)百

8、萬倍，通過瓊脂糖凝膠電泳，可以直接觀察產(chǎn)物的存在。因此，PCR技術(shù)對于鑒定陽性克隆十分有效，而且無需制備DNA。,,,（4） 酶切鑒定,,,目的基因表達,6.,（三）重組DNA技術(shù)的應用,1.DNA指紋技術(shù) 2.轉(zhuǎn)基因動物與動物克隆 3.基因診斷與基因治療,1.DNA指紋技術(shù),DNA指紋( DNA fingerprint )技術(shù)是20 世紀70年代末發(fā)展起來的遺傳標記的方法。 遺傳標記（gen

9、etic marker）是指可用來區(qū)分不同群體或個體，又能穩(wěn)定遺傳的某些物質(zhì)。 生物個體間的差異在本質(zhì)上是 DNA的差異，因此DNA是最可靠的遺傳標記。,（1）限制性片段長度多態(tài)性,真核生物的DNA分子很長，在遺傳過程中DNA堿基由于替換、重排、插入、缺失等原因，在子代DNA中會引起差異形成多態(tài)性。 當用一種限制性內(nèi)切酶去切DNA時，DNA分子會降解成許多長短不等的片段，個體間這些片段是特異的，可以作為某一DNA

10、（生物）的標記，將這種方法稱為限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）。,,,,個體 1,個體 2,在人體DNA文庫中發(fā)現(xiàn)的由9–70bp重復單位串聯(lián)重復排列而成的高變異區(qū)，稱為小衛(wèi)星DNA（minisatellite DNA）。不同個體的多態(tài)性來源于重復單位的重復次數(shù)不同，同一家族小衛(wèi)星重復單位含有相同或相似的核心序列，用某一小衛(wèi)星DNA作探針，可與同一

11、或不同物種多酶切DNA片段雜交，獲得DNA指紋圖譜（DNA fingerprint）。 所有真核生物基因組中還存在由2-6bp為重復單位的重復順序，因其重復單位比小衛(wèi)星短，稱為微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）。,真核生物的小衛(wèi)星DNA,人的DNA 指紋圖譜,,（2）隨機擴增多態(tài)性DNA,隨機擴增多態(tài)性DNA （Randomly Amplified polymorphic DNA，RAPD）， 又

12、稱隨機引物PCR。是以9–10 個核苷酸的隨機序列作引物， 以基因組DNA為模板進行PCR 擴增。產(chǎn)物電泳后紫外觀察， 不同個體的圖帶差異明顯， 如DNA指紋圖譜一樣。,,,,,個體 1,個體 2,2.轉(zhuǎn)基因動物與動物克隆,（1）轉(zhuǎn)基因動物 （2）體細胞克隆—無性繁殖,,1982 年，人們將大白鼠的生長激素基因放在質(zhì)粒中小白鼠金屬巰基蛋白啟動子之后 。 將重組好的這種質(zhì)粒，用特制的微量注射器注入小鼠受精

13、卵的雄性原細胞核中，再將這個受精卵植入小鼠子宮中。,（1）轉(zhuǎn)基因動物,,啟動子,結(jié)果為發(fā)育成熟的小鼠體重比對照小鼠大兩倍，成為“碩鼠”或“超級鼠”。,1986 年，美國制備出轉(zhuǎn)生長激素基因的豬。這種豬生長快，飼料轉(zhuǎn)換率和瘦肉率顯著提高而肥膘低，與注射生長激素的效果相同。 我國現(xiàn)制備出轉(zhuǎn)基因豬、羊、兔等。 然而，轉(zhuǎn)生長激素基因的豬生殖能力明顯下降，不能繁殖擴群。,,2019 年 7 月世

14、 界第一例從成年 動物體細胞，克 隆出的哺乳動物 綿羊“多利”誕生。 2019年2月 Nature雜志報道 將這個秘密向世人 公布。,（2）體細胞克隆—無性繁殖,克 隆 羊 多 利 的 產(chǎn) 生 過 程,,多利羊之父 威爾穆特教授

15、 —英國愛丁堡 羅斯林研究所， 蘇格蘭胚胎學 家。,2019年 克隆批量化,美國克隆出50多只老鼠。 日本克隆出8只完全一樣的小牛。,美國俄 勒岡州 沃爾小 組成功 克隆兩 只恒河 猴。,2000年·人類的近親被克隆,克隆豬 同年，幫助培育出多利羊的生物技術(shù)公司克隆出5只小豬仔，并宣稱

16、克隆豬終將成為人類移植器官的“加工廠”，生產(chǎn)器官包括角膜、皮膚、腎、肝 、肺、心臟等。 珍稀瀕危動物的繁殖 克隆大熊貓的實驗已開始報道。,2019年—至今關于克隆人,關于克隆人的問題爭論的很激烈，在理論上，利用同樣方法，人可以克隆人，但各國至今還不允許克隆人。 2019年，美、意科學家聯(lián)手展開克隆人體胚胎的工作。11月，美國科學家宣布首 次克隆成功了處于早期階段的人類胚胎， 稱其目標是為病人“定制”出不會誘

17、發(fā)排異 反應的人體細胞用于移植。,2019年8月11日英國頒發(fā)全球首張“克隆人類胚胎”執(zhí)照，合法執(zhí)照有效期為一年，胚胎14天后必須毀壞，培育克隆嬰兒仍屬非法行為。 研究目的 ① 增加人類對自身胚胎發(fā)育的理解；② 增加人類對高危疾病的認識和高危疾病治療方法的研究。,克隆動物存在的問題,克隆動物健康問題很多，世界各地的克隆動物流產(chǎn)、夭折、畸形現(xiàn)象非常嚴重。 盡管現(xiàn)在關于克隆的爭論很多，但有一點是肯定的，

18、那就是克隆技術(shù)遠不成熟，應用克隆技術(shù)時需格外慎重。 多利雖順利懷孕生子，但壽命短，2019年月 2 月 15 日，僅６歲半的多利羊死亡。,,3.基因治療,是指在特定靶細 胞的基因組中，插 入外源基因或用外 源基因置換異?；?因，使細胞表達本 來該基因不表達的 產(chǎn)物，籍以補償或 抑制異常表達的基 因，達到治療疾病 目的，稱為基因治 療（genetherapy）。,,,思考題,1.簡述