顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的miRNA、mRNA表達(dá)譜及其分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控研究.pdf

1、目的：
　　顱內(nèi)動(dòng)脈瘤在臨床上以自發(fā)腦出血、腦血管痙攣、動(dòng)眼神經(jīng)麻痹等局灶癥狀為主要表現(xiàn)，是最常見的腦血管病之一。先天性動(dòng)脈瘤占大部分人群，發(fā)病率達(dá)萬分之一，以40-66歲最為常見。調(diào)查結(jié)果顯示，約有10％的病人入院前死亡，但仍約有500萬以上的隱匿性顱內(nèi)動(dòng)脈瘤未被發(fā)現(xiàn)和診斷。盡管在近十年里，動(dòng)脈瘤的治療取得了長足的進(jìn)步，但其致死率仍高達(dá)30％-40％，且預(yù)后不甚理想。目前，該病發(fā)病機(jī)制仍存在廣泛爭(zhēng)議，致病機(jī)理尚不清楚。僅發(fā)現(xiàn)芬蘭

2、和日本人群中的發(fā)病率是其他人群的兩倍，在遺傳家系分析中找到了可能的相關(guān)基因，但并沒有進(jìn)行更深入的功能研究。
　　近年來，研究者們用基因芯片來檢測(cè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤相關(guān)基因mRNA水平的變化，發(fā)現(xiàn)Bcl-2，COL1A2，COL3A1，COL5A2，CXCL12，TIMP4，TNC這7個(gè)基因的表達(dá)水平在3個(gè)或以上研究中都發(fā)生了明顯變化。這些在基因轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)的研究均涉及到內(nèi)皮細(xì)胞功能的紊亂，壁細(xì)胞的缺失，炎癥細(xì)胞浸潤以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解。<

3、br>　　小RNA(microRNA)是由18-25個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA。成熟小RNA通過與靶mRNA的3'UTR（非翻譯區(qū)）互補(bǔ)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)其表達(dá)。據(jù)保守估計(jì)，小RNA調(diào)控約20％-30％的人類基因。研究顯示，小RNA的異常調(diào)控是某些疾病發(fā)生的重要因素之一，如腫瘤和癌癥。
　　迄今為止，研究者們尚未明確任何顱內(nèi)動(dòng)脈瘤致病的信號(hào)通路和關(guān)鍵因子，也未能通過相關(guān)基因的動(dòng)物模型模擬疾病的表型，更沒有任何小RNA在顱內(nèi)動(dòng)

4、脈瘤中的研究報(bào)導(dǎo)。
　　我們長期從事顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的臨床工作，并在科研中積累了大量的實(shí)驗(yàn)成果。我們發(fā)現(xiàn)microRNA與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤有著非常密切的關(guān)系。我們利用microRNA芯片對(duì)四例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤樣本進(jìn)行小RNA表達(dá)譜分析，通過RT-PCR驗(yàn)證后得到18個(gè)異常表達(dá)的microRNA。同時(shí)利用mRNA芯片分析技術(shù)對(duì)兩例顱內(nèi)動(dòng)脈瘤樣本進(jìn)行mRNA表達(dá)譜分析，通過數(shù)據(jù)篩選，得到11351個(gè)顱內(nèi)動(dòng)脈瘤mRNA表達(dá)量數(shù)據(jù)。利用IPA(Ingenu

5、ity pathway analysis)系統(tǒng)，建立了顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病相關(guān)通路的分子網(wǎng)絡(luò)以及篩選這些miRNA對(duì)應(yīng)的顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病相關(guān)的致病靶基因，發(fā)現(xiàn)這些異常表達(dá)的miRNA主要與血管內(nèi)壁細(xì)胞凋亡、促進(jìn)炎癥細(xì)胞增殖與浸潤、內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的遷移等基因相關(guān)。
　　本課題將進(jìn)行miRNA及其靶基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤致病機(jī)制的研究，探求其調(diào)控的分子網(wǎng)絡(luò)在瘤體發(fā)生和發(fā)展中的作用，從時(shí)間和空間水平揭示miRNA調(diào)控顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的分子體

6、系。評(píng)估m(xù)iRNA作為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤生物標(biāo)記的可能性，為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤提供新的診斷位點(diǎn)和治療干預(yù)新靶點(diǎn)。本課題將為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的分子機(jī)制提供有價(jià)值的研究成果。
　　方法
　　1.篩選在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中異常表達(dá)并具有顯著生物學(xué)意義的microRNA。
　　2.篩選在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中異常表達(dá)并具有顯著生物學(xué)意義的mRNA。
　　3.確定microRNA調(diào)控的關(guān)鍵靶基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤組織中的表達(dá)水平，建立顱內(nèi)動(dòng)脈瘤發(fā)病的分子調(diào)控系統(tǒng)。

7、r>　　4.分析顱內(nèi)動(dòng)脈瘤形成和發(fā)展過程中microRNA對(duì)細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響，確定其在致病機(jī)理中發(fā)揮的功能。
　　結(jié)果
　　1.應(yīng)用Agilent Human miRNA array AMADID1643芯片對(duì)4組動(dòng)脈瘤樣本及對(duì)照組織樣本進(jìn)行初步的篩選后，得到有異常表達(dá)的miRNA32種，對(duì)其中的29種miRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證（針對(duì)新采集的10組動(dòng)脈瘤樣本）后，有18種miRNA在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤中異常表達(dá)。

8、>　　2.應(yīng)用Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray(4×44K)芯片對(duì)2組動(dòng)脈瘤樣本及對(duì)照組織樣本進(jìn)行篩選后，得到有異常表達(dá)的mRNA11351個(gè)。
　　3.應(yīng)用綜合性分析系統(tǒng)IPA，對(duì)18種miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)與mRNA芯片結(jié)果對(duì)應(yīng)的靶基因?qū)Ρ扔?24個(gè)基因重疊。
　　4.構(gòu)建動(dòng)脈瘤致病相關(guān)的分子網(wǎng)絡(luò)后，異常表達(dá)的miRNA所對(duì)應(yīng)的靶基因主要在以下方面參

9、與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的致病:血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、炎癥免疫細(xì)胞的增殖和浸潤、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的遷移。
　　5.分析IPA建立的動(dòng)脈瘤致病機(jī)理的分子網(wǎng)絡(luò)，炎癥因子在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成和發(fā)展中扮演了重要角色。
　　結(jié)論
　　1.microRNA及其對(duì)應(yīng)的靶基因在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的致病機(jī)理中扮演重要的角色。
　　2.microRNA在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的形成中主要通過內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡、炎癥免疫細(xì)胞的增殖和浸潤、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的遷移等機(jī)制發(fā)