基因轉(zhuǎn)染飼養(yǎng)細(xì)胞對(duì)造血干-祖細(xì)胞體外增殖和自我更新的影響及分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 比較人白血病抑制因子(hLIF)的不同添加方式對(duì)臍血造血干/祖細(xì)胞體外增殖過程中自我更新和歸巢潛能的影響，并研究hLIF對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路的激活作用及其在維持造血干細(xì)胞增殖和自我更新過程中的分子機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.將本科室構(gòu)建成功并鑒定正確的重組腺病毒載體Ad-hLIF和Ad-GFP體外感染W(wǎng)I-38細(xì)胞(一組為重組腺病毒直接感染W(wǎng)I-38細(xì)胞，另一組為先將WI-38細(xì)胞接種于絲

2、素膜上，再用腺病毒感染)，經(jīng)RT-PCR、ELISA法檢測hLIF在飼養(yǎng)層細(xì)胞中的表達(dá)。
　　 2.將Ad-hLIF及Ad-GFP等感染的WI-38細(xì)胞作為臍血造血干/祖細(xì)胞體外培養(yǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞(或直接添加hLIF)，并以細(xì)胞因子等組作為對(duì)照，體外培養(yǎng)7d后，通過流式細(xì)胞儀檢測法和Transwell法，比較各組干細(xì)胞體外培養(yǎng)后細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)變化，以判斷細(xì)胞的分化及歸巢潛能，并培養(yǎng)30d后觀測各組細(xì)胞的擴(kuò)增情況。
　

3、　 3.在基因轉(zhuǎn)染飼養(yǎng)層組、空載體組和細(xì)胞因子組共培養(yǎng)體系中中加入JAK/STAT信號(hào)通路的特異性阻斷劑AG490，并設(shè)無阻斷劑的對(duì)照組，共培養(yǎng)7d后流式細(xì)胞術(shù)檢測表面黏附分子的表達(dá)量，Transwell法檢測干細(xì)胞的歸巢能力。
　　 4.RT-PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中STAT3的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。
　　 5.Western blot法檢測各培養(yǎng)體系干細(xì)胞中p-STAT3和活化的蛋白激酶p-JAK1

4、、p-JAK2的表達(dá)變化，做28d的長期培養(yǎng)后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線，并在不同時(shí)間點(diǎn)流式細(xì)胞術(shù)檢測CD34+的比例，比較阻斷前后干細(xì)胞自我更新能力的維持。
　　 結(jié)果：
　　 1.用RT-PCR、ELISA法檢測到轉(zhuǎn)染Ad-hLIF的WI-38飼養(yǎng)層細(xì)胞中有hLIF基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)；
　　 2.造血干/祖細(xì)胞直接加在飼養(yǎng)層上面和飼養(yǎng)層細(xì)胞懸浮于干細(xì)胞培養(yǎng)體系中均能對(duì)造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增和自我更新發(fā)揮重要作

5、用，兩者之間沒有顯著差異，直接添加hLIF的方式對(duì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增和自我更新能力的維持作用顯著低于前兩種添加方式；
　　 3.加入JAK/STAT信號(hào)通路的阻斷劑后，干細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)和體外歸巢能力均降低，RT-PCR法和免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測到加入阻斷劑前后干細(xì)胞中STAT3的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)沒有明顯變化；
　　 4.Western blot法檢測到加入阻斷劑后干細(xì)胞中STAT3和蛋白酪氨酸激酶JAK1、JAK2的活化明顯受

6、到抑制，并且加入阻斷劑后干細(xì)胞增長速度明顯變慢，相同時(shí)間點(diǎn)加入阻斷劑培養(yǎng)的干細(xì)胞CD34+比例低于未添加組，兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.干細(xì)胞直接加于飼養(yǎng)層細(xì)胞上或飼養(yǎng)層細(xì)胞懸浮于干細(xì)胞培養(yǎng)體系中均對(duì)造血干細(xì)胞體外擴(kuò)增和維持自我更新發(fā)揮重要作用，兩者間無顯著差異；
　　 2.飼養(yǎng)層細(xì)胞分泌hLIF的添加方式明顯優(yōu)于直接添加細(xì)胞因子hLIF；
　　 3.飼養(yǎng)層分泌的hLIF可以成功激