光刺激對(duì)光基因化干細(xì)胞增殖和自我更新影響的研究.pdf

1、視網(wǎng)膜變性疾病是一類嚴(yán)重的致盲性眼病，我國(guó)每年近200萬患者因該類疾病導(dǎo)致失明。以干細(xì)胞移植為代表的細(xì)胞替代療法有望恢復(fù)變性視網(wǎng)膜的感光能力，具有良好的臨床應(yīng)用前景，目前已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。干細(xì)胞分化來源的神經(jīng)元必須通過與宿主視網(wǎng)膜存留的神經(jīng)元建立有功能的突觸連接，才能恢復(fù)視覺信息的傳遞。目前多種研究提供了移植入視網(wǎng)膜的干細(xì)胞分化來源的細(xì)胞與宿主神經(jīng)元細(xì)胞建立突觸連接的形態(tài)學(xué)證據(jù)，但由于技術(shù)瓶頸的限制，未能檢測(cè)突觸連接的功能。光遺傳學(xué)

2、技術(shù)的發(fā)展為探討這一問題提供了平臺(tái)，通過基因轉(zhuǎn)染，使干細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)光敏感陽離子通道蛋白和綠色熒光蛋白(channelrhodopsin2，ChR2; green fluorescent protein，GFP)，移植入視網(wǎng)膜后，GFP用于示蹤干細(xì)胞的定位，470nm波長(zhǎng)的藍(lán)光可激活細(xì)胞ChR2引起興奮，然后通過膜片鉗技術(shù)記錄周圍宿主神經(jīng)元的突觸后電流，研究移植干細(xì)胞來源的神經(jīng)元與宿主視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能整合。而進(jìn)行該研究的前提是構(gòu)建表達(dá)C

3、hR2的光基因化干細(xì)胞，并對(duì)光基因化干細(xì)胞生物學(xué)特征是否發(fā)生改變進(jìn)行評(píng)估。但目前光刺激對(duì)光基因化神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的增殖和自我更新是否產(chǎn)生影響尚缺乏明確的數(shù)據(jù)支持。
　　以往研究提示，干細(xì)胞的增殖及自我更新受到胞內(nèi)和胞外多種因素的調(diào)控。如胚胎干細(xì)胞(mouse embryonic stem cells，mESCs)的Oct4/Sox2/Nanog核心轉(zhuǎn)錄因子形成調(diào)控環(huán)路能夠保持mESCs的干性穩(wěn)定;神經(jīng)干細(xì)胞(neural s

4、tem cells，NSCs)中的p21/p27對(duì)于調(diào)控NSCs的適度增殖及保持干細(xì)胞庫的穩(wěn)定具有重要意義。干細(xì)胞的干性狀態(tài)維持不僅僅依賴內(nèi)源性調(diào)控因子的活動(dòng)，多種外界因素比如受體激動(dòng)劑如白介素抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、機(jī)械力及離子環(huán)境均可影響干細(xì)胞的狀態(tài)。尤其是分布在干細(xì)胞膜表面的離子通道活動(dòng)改變與干細(xì)胞的增殖和自我更新等過程密切相關(guān)。以往由于缺乏特異快速的刺激手段，離子通道活動(dòng)改變對(duì)于

5、干細(xì)胞干性狀態(tài)的調(diào)控還需要深入的研究。光遺傳學(xué)技術(shù)具有時(shí)間和空間精確性的優(yōu)勢(shì)，特別適用于研究離子通道功能改變對(duì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　因此，本課題通過攜帶ChR2-GFP的慢病毒感染mESCs和NSCs，F(xiàn)ACS篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ChR2-GFP的mESCs和NSCs，并運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、電生理以及光遺傳學(xué)技術(shù)，評(píng)價(jià)光刺激對(duì)ChR2-GFP-V6.5 mESCs和ChR2-GFP-C17.2NSCs增殖和自我更新的影

6、響，并初步探討與之相關(guān)的分子機(jī)制。
　　方法:
　　1.攜帶ChR2-GFP慢病毒感染V6.5 mESCs和C17.2 NSCs，并通過熒光活化細(xì)胞分選系統(tǒng)(fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS)篩選ChR2-GFP陽性的細(xì)胞，進(jìn)行擴(kuò)增;
　　2.通過免疫熒光染色及Real-time PCR檢測(cè)ChR2-GFP-V6.5 mESCs和ChR2-GFP-C17.2 NSCs干細(xì)

7、胞標(biāo)記物的表達(dá)水平;通過光刺激膜片鉗檢測(cè)470nm波長(zhǎng)的藍(lán)光是否能誘導(dǎo)ChR2-GFP-V6.5 mESCs和ChR2-GFP-C17.2 NSCs產(chǎn)生內(nèi)向的光電流;
　　3.通過細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)及干細(xì)胞標(biāo)記物檢測(cè)確定表達(dá)ChR2-GFP對(duì)mESCs和NSCs形態(tài)及增殖的影響;
　　4.通過光刺激后細(xì)胞計(jì)數(shù)、流式分析細(xì)胞周期及Ki67染色半定量分析確定光刺激對(duì)細(xì)胞增殖及周期進(jìn)展的影響;并通過臺(tái)盼藍(lán)染色及流式分析細(xì)

8、胞凋亡，確定光刺激是否影響細(xì)胞活性;
　　5.通過Real-time PCR檢測(cè)光刺激對(duì)ChR2-GFP-V6.5 mESCs核心轉(zhuǎn)錄因子的影響，通過AP染色確定自我更新能力的改變;并檢測(cè)光刺激后不同胚層標(biāo)記物表達(dá)水平的改變。
　　6.通過Western-blot檢測(cè)光刺激后ChR2-GFP-V6.5 mESCs的ERK活性改變及ChR2-GFP-C17.2 NSCs中p21和p27表達(dá)水平的改變。
　　結(jié)果:

9、　　1.攜帶ChR2-GFP的慢病毒感染C17.2 NSCs和V6.5 mESCs，觀察到ChR2-GFP的表達(dá)。通過FACS篩選出穩(wěn)定表達(dá)ChR2-GFP的單細(xì)胞來源的C17.2 NSCs和V6.5 mESCs。
　　2.ChR2-GFP-C17.2 NSCs和ChR2-GFP-V6.5 mESCs形態(tài)及增殖無顯著變化;且均表達(dá)相應(yīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物，具備干細(xì)胞的特征。
　　3.ChR2-GFP-C17.2 NSCs和ChR2

10、-GFP-V6.5 mESCs對(duì)470nm波長(zhǎng)的藍(lán)光刺激均有反應(yīng)，ChR2激活產(chǎn)生內(nèi)向的光電流，且電流幅值具有光強(qiáng)度依賴效應(yīng)。
　　4.光刺激明顯抑制ChR2-GFP-C17.2 NSCs的增殖速度及阻礙細(xì)胞周期中G1/S期轉(zhuǎn)換;光刺激明顯抑制ChR2-GFP-V6.5 mESCs的增殖速度及減少S期比例，同時(shí)顯著降低維持自我更新的核心轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Nanog、Esrrb及Klf4的表達(dá)水平，減少單細(xì)胞形成AP陽性克

11、隆的數(shù)量;光刺激不影響ChR2-GFP-C17.2 NSCs和ChR2-GFP-V6.5 mESCs的活性，也不引起凋亡。
　　5.光刺激后引起ChR2-GFP-C17.2 NSCs細(xì)胞膜去極化，上調(diào)p21和p27的表達(dá)水平，參與抑制細(xì)胞增殖及周期進(jìn)展。光刺激后引起ChR2-GFP-V6.5 mESCs的胚層特異性相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，尤其是外胚層相關(guān)基因Cdx2、Fgf5及Nestin的表達(dá)水平顯著升高;光刺激后ERK分子的磷酸化

12、水平顯著升高。光刺激后下調(diào)ChR2-GFP-V6.5 mESCs克隆內(nèi)細(xì)胞之間縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)水平。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建光基因化的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞，可用于干細(xì)胞移植入變性視網(wǎng)膜后功能整合的研究。
　　2.光刺激抑制光基因化的小鼠神經(jīng)干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展及自我更新，還可引發(fā)胚胎干細(xì)胞分化的啟動(dòng)，提示在處理細(xì)胞過程中要做好避光處理，避免影響干細(xì)胞生物學(xué)特性。
　　3.光刺