永生化骨骺干細胞株的建立及PTHrP亞基因?qū)趋扛杉毎鲋澈头只挠绊?pdf

1、目的：體外分離、培養(yǎng)、鑒定骨骺干細胞并誘導其永生化，建立高水平誘導、低背景表達的骨骺干細胞株，研究甲狀旁腺相關蛋白亞基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)對體外培養(yǎng)的骨骺干細胞的調(diào)控作用以及PTHrP(107-139)與其他調(diào)控因子的相互影響。
　　 方法：采用顯微取材和免疫磁性分選技術(shù)分離純化具有成纖維生長因子受體-3（fibroblast growth factor recepto

2、r-3，F(xiàn)GFR-3）特異性表面標志的骨骺干細胞。利用電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將含有猿腎病毒40大T抗原基因（SV40Tag）的質(zhì)粒pCMVSV40T/PUR轉(zhuǎn)染骨骺干細胞，經(jīng)嘌呤霉素篩選，抗性克隆擴大培養(yǎng)獲得永生化骨骺干細胞。提取骨骺干細胞的總RNA，以RT-PCR方法獲得帶有酶切位點的PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)基因片段，擴增的DNA片段分別與載體pTRE-2Hyg雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化擴增后對重

3、組質(zhì)粒進行提取和酶切、測序鑒定。用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將pTet-on質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于骨骺干細胞，G418篩選得到穩(wěn)定克隆，再瞬時轉(zhuǎn)染pTRE-2Hyg-Luc質(zhì)粒并篩選出高水平誘導、低背景表達的pTet-on骨骺干細胞系。用脂質(zhì)體介導的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將將質(zhì)粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)分別轉(zhuǎn)染高水平誘導、低背景表達的-pTet-on骨骺干細胞株，放入誘導分化培

4、養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，加入強力霉素進行誘導，以RT-PCR的方法檢測PCNA基因的表達變化。應用RT-PCR的方法檢測不同濃度的強力霉素下質(zhì)粒pTRE-PTHrP(107-139)轉(zhuǎn)染組的ColⅡ、Col Ⅹ、Ihh、Ptc、Sox9、BMP6基因的表達變化。
　　 結(jié)果：經(jīng)免疫細胞化學證實所取材分離并純化的細胞為骨骺干細胞。SV40Tag穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入骨骺干細胞經(jīng)擴大培養(yǎng)，命名為永生化骨骺干細胞。從骨骺干細胞中克隆出的PTHrP亞克隆基

5、因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)經(jīng)酶切圖譜分析和DNA序列測定證實已經(jīng)插入重組質(zhì)粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)。pTet-on質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于骨骺干細胞，并瞬時轉(zhuǎn)染pTRE-2Hyg-Luc質(zhì)粒獲得1株誘導后熒光素酶的表達活性增加50倍的pTet-on骨骺干細胞株。強力霉素誘導的質(zhì)粒pTRE-PTHrP(107-13

6、9)轉(zhuǎn)染組的PCNA表達明顯高于質(zhì)粒pTRE-PTHrP(1-36)轉(zhuǎn)染組和質(zhì)粒pTRE-PTHrP(38-94)轉(zhuǎn)染組；在強力霉素誘導的質(zhì)粒pTRE-PTHrP(107-139)轉(zhuǎn)染組中ColⅡ、Sox-9表達明顯增強，Ihh表達未見明顯變化，而 Ptc、Col Ⅹ、BMP6表達明顯降低。而且其表達量與強力霉素存在劑量依賴性。
　　 結(jié)論：運用顯微取材和免疫純化技術(shù)可以成功分離純化骨骺干細胞。經(jīng)SV40Tag轉(zhuǎn)染構(gòu)建了永生化的

7、骨骺干細胞株。成功克隆出PTHrP亞克隆基因PTHrP(1-36)、PTHrP(38-94)和PTHrP(107-139)并構(gòu)建了反應質(zhì)粒pTRE-PTHrP(1-36)、pTRE-PTHrP(38-94)和pTRE-PTHrP(107-139)。篩選得到的pTet-on骨骺干細胞株受強力霉素誘導后能夠低背景、高水平表達。PTHrP(107-139)可能是通過調(diào)控Sox-9、Ptc、BMP6的表達來促進骨骺干細胞增殖并抑制其分化的，而P