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文檔簡介
1、中山大學碩士學位論文轉(zhuǎn)染hTERT基因建立永生化成釉細胞瘤細胞株的實驗研究姓名:呂標申請學位級別:碩士專業(yè):口腔臨床醫(yī)學指導教師:陶謙20090518中山大學碩七學位論文轉(zhuǎn)染hTERT基因建立永生化成釉細胞瘤細胞株的實驗研究等生物學特點提供了有價值的體外模型。材料和方法1參照分子克隆技術(shù)構(gòu)建含有hTERT基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXSNneohTERT,用脂質(zhì)體法將pLXSNneo—hTERT轉(zhuǎn)染至PA317細胞,經(jīng)G418藥物壓力篩選,
2、建立產(chǎn)毒的PA317病毒包裝細胞系,測定病毒滴度。2收集手術(shù)切除的AM腫瘤組織,組織塊法進行細胞原代培養(yǎng),腫瘤細胞爬出后常規(guī)消化傳代,采用差速消化法去除腫瘤細胞中混雜的成纖維細胞,免疫細胞化學(Immunocytochemistry,ICC)鑒定細胞的上皮來源。3收集病毒包裝PA317細胞的培養(yǎng)上清液,感染AM細胞,G418篩選抗性克隆,擴增培養(yǎng),建立永生化AM細胞株。4采用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài);ICC檢測廣譜細胞角蛋白(PANeyt
3、okeratin,pCK)、波形蛋白(Vimentin,Vim)表達;繪制細胞生長曲線;計算細胞群體倍增時間(DoublingTime,DT)及群體倍增數(shù)(PopulationDoublings,PDL),繪制細胞倍增曲線:細胞衰老口半乳糖苷酶(SenescenceAssociatedDGalactosidase,SA13Gal)染色檢測細胞衰老;端粒重復序列擴增(Telomericrepeatamplification,TRAP)銀染
4、法檢測轉(zhuǎn)染前后AM細胞中端粒酶活性表達;兩步法逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(Reversetranscription—polymerasechainreaction,RTPCR)檢測轉(zhuǎn)染前后AM細胞中hTERT、p16、p21和p53基因的表達情況;Westemblot檢測轉(zhuǎn)染前后AM細胞中hTERT、p16、p21和p53蛋白的表達情況;以106個細胞接種裸鼠檢測腫瘤形成。結(jié)果I雙酶切鑒定及測序結(jié)果顯示pLXSNneohTERT重組逆轉(zhuǎn)錄病毒
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