TIMP-2基因轉(zhuǎn)染抑制成釉細(xì)胞瘤侵襲性生長的實驗研究.pdf

1、成釉細(xì)胞瘤(ameloblastoma，AM)是口腔頜面部最常見的牙源性腫瘤，約占牙源性腫瘤的59.3％。AM雖為良性腫瘤，但具有局部侵襲性，腫瘤細(xì)胞常向骨小梁間侵襲生長。臨床治療容易復(fù)發(fā)，反復(fù)多次手術(shù)給患者造成嚴(yán)重的面部畸形，并有可能惡變。因此，AM的治療常使口腔頜面外科臨床醫(yī)生處于兩難之地。對AM侵襲機制的研究一直是口腔頜面外科醫(yī)師最為關(guān)心的問題，也是AM研究的難點及熱點之一。 到目前為止，成釉細(xì)胞瘤的局部侵襲機制尚未明了。

2、一般認(rèn)為，腫瘤侵襲主要是指腫瘤細(xì)胞侵犯和破壞周圍正常組織的過程。腫瘤細(xì)胞的周邊為結(jié)締組織，即基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，這些結(jié)構(gòu)的降解與破壞是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移多階段過程中的重要步驟。細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要組織結(jié)構(gòu)為膠原、層粘素和纖維結(jié)合素等，這些結(jié)構(gòu)的破壞與降解需要相應(yīng)的溶解酶參與。研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMPs)和相應(yīng)的基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(tissueinhibitorofmetallo

3、proteinase，TIMPs)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中擔(dān)任了重要的角色。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶—2(MMP—2)是目前研究發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲關(guān)系最為密切的一種基質(zhì)金屬蛋白酶。 已有的研究表明，MMP—2的調(diào)節(jié)具有三個水平，即基因轉(zhuǎn)錄水平、酶原的活化激活水平、抑制劑水平。在本課題組的前期研究中，應(yīng)用MMP—2的特異化學(xué)抑制劑R031-9790明顯抑制了MMP—2的活性，并使裸鼠腎包膜下AM移植瘤的生長被抑制。應(yīng)用靶向RNA干擾技術(shù)

4、，特異性的使MMP-2基因沉默，抑制了MMP-2基因的表達(dá)，AM的侵襲性被明顯抑制，MMP-2與AM細(xì)胞的侵襲性密切相關(guān)。 TIMP-2是MMP-2的天然抑制劑。TIMP-2基因定位于人17q23-17q25，它編碼蛋白分子量為21kDa。TIMP-2與MMP-2形成復(fù)合物，抑制明膠酶的活性。TIMP-2既可與活化的MMP-2也可與非活化的MMP-2以共價鍵形式結(jié)合，還可以抑制金屬蛋白酶家族所有成員的水解活性。TIMP-2還能抑

5、制腫瘤的血管生成。TIMP-2參與細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控有關(guān)。TIMPs對細(xì)胞存活的調(diào)控機制目前還不確定，可能通過兩條路徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活，一個是與其抗MMP活性有關(guān)，另外一個是MMP非依賴性途徑，包括誘導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclinependentkinase，CDK)抑制劑p21產(chǎn)生、α-腫瘤壞死因子受體通路、BCL2與BCL-XL通路等?？傊?，TIMP-2與MMP-2的活性以及腫瘤的侵襲生長密切相關(guān)。 本

6、研究旨在將TIMP-2基因轉(zhuǎn)染至成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞，使TIMP-2基因過表達(dá)以阻斷MMP-2的活性。從而抑制成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞的局部侵襲性生長。探討TIMP-2基因過表達(dá)后成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲行為的變化，從分子水平闡明成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲的機制。同時，本研究分別從細(xì)胞水平、器官水平以及體內(nèi)水平觀察分析TIMP-2基因轉(zhuǎn)染后成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞、成釉細(xì)胞雞胚尿囊膜移植瘤以及裸鼠皮下移植瘤的生長及侵襲性的改變，為成釉細(xì)胞瘤的基因治療奠定實驗基礎(chǔ)。 本

7、研究分四個部分： 第一部分TIMP-2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞的表達(dá)研究 目的：構(gòu)建含有綠色熒光蛋白報告基因的TIMP-2真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/GFP-TIMP-2并轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的人成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞。為深入研究TIMP-2基因與成釉細(xì)胞瘤局部侵襲生長的關(guān)系以及后續(xù)實驗研究奠定基礎(chǔ)。 結(jié)論: 1、成功構(gòu)建帶有綠色熒光蛋白報告基因的TIMP—2的真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/

8、GFP—TIMP—2，經(jīng)酶切及測序鑒定正確。 2、pcDNA3.1(+)/GFP—TIMP—2成功轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)人成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞，并檢測到TIMP—2mRNA表達(dá)增加。 3、RPMI1640培養(yǎng)基適用于人成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞的體外培養(yǎng)。 第二部分TIMP—2基因轉(zhuǎn)染抑制成釉細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲性的實驗研究 目的：將第一部分構(gòu)建的TIMP—2真核表達(dá)載體：pcDNA3.1(+)/GFP—TIMP—2，轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的A

9、M細(xì)胞，使TIMP—2基因過表達(dá)，從基因及MMP—2天然抑制劑水平調(diào)控MMP—2的活性，探討TIMP—2基因轉(zhuǎn)染后體外培養(yǎng)的AM細(xì)胞侵襲性生物學(xué)行為的改變，進(jìn)一步研究MMP—2、TIMP—2與AM局部侵襲性的關(guān)系。 結(jié)論：　　1、TIMP—2基因轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞后，TIMP—2的mRNA及蛋白表達(dá)增加，蛋白活性亦增加；MMP—2mRNA表達(dá)量無明顯改變，其蛋白表達(dá)量及活性降低?！　?、TIMP—2基因轉(zhuǎn)染AM細(xì)胞后，細(xì)胞的侵襲性

10、被部分抑制?？赡軝C制是TIMP—2基因過表達(dá)使MMP—2活性降低所致?！　?、TIMP—2、MMP—2以及二者的關(guān)系可能是影響AM局部侵襲性生長的原因之一。 第三部分TIMP—2基因轉(zhuǎn)染對成釉細(xì)胞瘤雞胚尿囊膜移植瘤影響的實驗研究研究 目的：在構(gòu)建成釉細(xì)胞瘤雞胚尿囊膜(chickenchorioallantoicmembrane，CAM)移植瘤模型的基礎(chǔ)上，通過在移植瘤周圍應(yīng)用TIMP—2真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+

11、)/GFP—TIMP—2，研究TIMP—2基因轉(zhuǎn)染對成釉細(xì)胞瘤雞胚尿囊膜移植瘤的影響。 結(jié)論：　　1、成功建立成釉細(xì)胞瘤的CAM移植瘤模型。　　2、TIMP—2基因轉(zhuǎn)染后，成釉細(xì)胞瘤CAM移植瘤的侵襲性生長被抑制。移植瘤的侵襲性生長被抑制的可能原因是由于特異性抑制MMP—2蛋白引起的。 第四部分TIMP—2基因轉(zhuǎn)染對成釉細(xì)胞瘤裸鼠移植瘤影響的實驗研究研究. 目的：在構(gòu)建AM裸鼠皮下移植瘤模型的基礎(chǔ)上，通過在裸