用雜交瘤技術(shù)建立永生化肝細胞研究藥物代謝.pdf

1、研究背景：原代肝細胞由于包含幾乎肝臟所有的藥物代謝酶及相應(yīng)輔助因子，代謝功能與體內(nèi)肝細胞相似，一直是體外藥物代謝研究推崇的經(jīng)典模型。但原代肝細胞體外分離培養(yǎng)條件復(fù)雜、藥物代謝酶活性維持時間短、不能傳代培養(yǎng)長期使用等弊端，導(dǎo)致原代肝細胞的應(yīng)用成本較高、缺乏靈活性。因此，藥物代謝研究領(lǐng)域迫切需要建立原代肝細胞的理想替代模型。 研究目的：選擇適宜種屬和組織起源的腫瘤細胞株，采用雜交瘤技術(shù)將其與原代肝細胞融合，建立既具有原代肝細胞正常藥

2、物代謝活性，又具有腫瘤細胞無限增殖能力，可體外長期培養(yǎng)傳代利用的永生化肝細胞(肝雜交瘤細胞株)。 研究內(nèi)容：分離、培養(yǎng)、凍存具備良好藥物代謝活性的大鼠原代肝細胞；誘變篩選不同種屬及組織起源的HGPRT基因缺陷(HGPRT)型腫瘤細胞株作為親本瘤細胞的考察；利用雜交瘤技術(shù)將原代肝細胞與不同親本瘤細胞株融合，建立符合藥物代謂研究要求、具備良好藥物代謝酶活性的肝雜交瘤細胞株，并對其生物學(xué)特性及功能進行鑒定；評價肝雜交瘤細胞株在體外藥物

3、代謝研究中的應(yīng)用價值。 技術(shù)方法：改進膠原酶二步灌流法分離培養(yǎng)大鼠原代肝細胞；化學(xué)誘變劑誘變、細胞克隆化培養(yǎng)、HAT篩選鑒定HGPRT型腫瘤細胞株；PEG化學(xué)融合法進行細胞融合實驗；相關(guān)的細胞功能檢測和鑒定綜合采用形態(tài)學(xué)觀察、HAT篩選、染色體核型分析、雙熒光標(biāo)記共聚焦激光掃描檢測以及特征性生化指標(biāo)包括糖原合成、白蛋白分泌和尿素合成功能的測定；細胞的藥物代謝活性評價采用底物孵育法，HPLC和LC-MS技術(shù)檢測。 結(jié)果：優(yōu)

4、化建立了大鼠原代肝細胞的分離培養(yǎng)方法，所得原代肝細胞保持分泌白蛋白、合成尿素和糖原等肝細胞特征生物合成功能，具備全面良好的450酶代謝活性；克隆篩選了HAT敏感的HGPRT型人SMMC-7721肝癌細胞、小鼠骨髓瘤SP2/0細胞和大鼠H4TG肝癌細胞3株不同種屬和組織起源的腫瘤細胞作為親本瘤細胞進行與原代肝細胞的融合實驗考察，得到的3株不同融合細胞表現(xiàn)出不同的培養(yǎng)特性。肝-7721雜交瘤細胞和肝-H4TG雜交瘤細胞能長期傳代培養(yǎng)且具備藥

5、物代謝活性。其中肝-H4TG雜交瘤細胞株在長期培養(yǎng)傳代過程中表現(xiàn)出較好的形態(tài)學(xué)和生物合成功能穩(wěn)定性，目前已在體外培養(yǎng)5月余，純化傳代25次。具備幾種典型P450亞型酶活性，純化傳代5次的肝雜交瘤細胞各典型P450酶活性約為原代肝細胞的40-50％，純化傳代10次后CYP2C、CYP3A活性有所下降，但CYP1A、CYP2D活性無明顯改變。 結(jié)論：3種不同種屬和組織起源的親本瘤細胞與大鼠原代肝細胞融合的結(jié)果傾向于表明：原代肝細胞與

6、同組織起源的肝癌細胞融合比與異組織起源的腫瘤細胞融合效率高；原代肝細胞與同種屬的腫瘤細胞融合比與異種屬腫瘤細胞融合穩(wěn)定。即應(yīng)選擇同種屬起源的肝癌細胞株與原代肝細胞融合建立肝雜交瘤細胞。 目前結(jié)果表明，大鼠肝-H4TG雜交瘤細胞株至少在較長的一段培養(yǎng)時期內(nèi)能保持較好的藥物代謝活性，在一定程度上可作為原代肝細胞的替代模型應(yīng)用于藥物代謝研究領(lǐng)域。但對其代謝活性的長期穩(wěn)定維持，可能尚有未知影響因素與機制的參與和作用，值得做進一步深入探討