鴨源雞桿菌抗體消長規(guī)律研究及抗脂多糖單抗雜交瘤細(xì)胞株的建立.pdf

1、鴨源雞桿菌(Gallibacterium anatis)是巴氏桿菌科,雞桿菌屬的代表種。該菌可參與感染產(chǎn)蛋母雞,引發(fā)一系列慢性、進(jìn)行性生殖道疾病,如輸卵管炎、輸卵管囊腫,是引起產(chǎn)蛋量下降的一個(gè)重要病原體。近年來,國內(nèi)外對于鴨源雞桿菌的研究主要是針對其致病性和發(fā)病機(jī)理,對于鴨源雞桿菌的血清學(xué)研究較少。
　　 本研究利用實(shí)驗(yàn)室保存的鴨源雞桿菌菌株YU-PDS-RZ-1-SLG制備超聲波裂解抗原,建立了可以檢測鴨源雞桿菌所有血清型抗體

2、的間接ELISA方法:包被抗原濃度為10μg·mL-1,包被條件為37℃2h,然后4℃過夜,封閉液為1％明膠,封閉條件為37℃1h,陰、陽性血清最佳稀釋度為1:100,酶標(biāo)二抗工作濃度為1:1000,底物顯色時(shí)間為15min。經(jīng)交叉性試驗(yàn)、阻斷試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)證實(shí)建立的ELISA方法重復(fù)性好,特異性強(qiáng)。板內(nèi)變異系數(shù)為2.01％～5.75％,板間變異系數(shù)為2.43％～6.20％。間接ELISA方法的靈敏度是微量凝集試驗(yàn)的25～100倍。利

3、用所建立的ELISA方法檢測了人工感染鴨源雞桿菌的3日齡SPF雞在感染后不同階段感染組,同居組和空白對照組的血清抗體1:10稀釋后的OD450,根據(jù)感染后不同階段所測OD450繪制抗體消長曲線,大致了解了其抗體消長的規(guī)律:抗體水平在感染后2個(gè)月左右達(dá)到高峰,但維持時(shí)間較短,隨后逐漸下降。建立的間接ELISA方法可以用于臨床病例的血清學(xué)快速檢測,為進(jìn)行鴨源雞桿菌的血清流行病學(xué)調(diào)查、免疫程序的制定及免疫效果的評價(jià)提供了手段。
　　

4、利用實(shí)驗(yàn)室保存的鴨源雞桿菌菌株YU-PDS-RZ-1-SLG提取鴨源雞桿菌脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)作為檢測抗原,確定ELISA方法的最佳工作條件:包被抗原的濃度為2.77μg·mL-1,包被條件為37℃1.5h,4℃過夜,封閉液為1％明膠,封閉條件為37℃1h,陰、陽性血清最佳稀釋度為1:1600,酶標(biāo)二抗工作濃度為1:3000,底物顯色時(shí)間為15min。
　　 將鴨源雞桿菌裂解抗原及提取的脂多糖

5、用PBS稀釋到適當(dāng)濃度,加入弗氏完全/不完全佐劑制成乳化抗原免疫Balb/c小鼠。按常規(guī)方法進(jìn)行融合,用間接ELISA方法進(jìn)行篩選,采用有限稀釋法,經(jīng)過4次亞克隆,最終獲得3株抗鴨源雞桿菌脂多糖的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1H11、1B12和4D4。經(jīng)過長期的體外培養(yǎng)和長期的凍存復(fù)蘇后,3株雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的能力略有降低,但仍能均一分泌抗體。間接ELISA方法檢測3株雜交瘤細(xì)胞上清效價(jià)分別為:1:3200、1:6400、1:3200,小