PEDV變異株S、M蛋白原核表達(dá)及分泌抗S蛋白單抗雜交瘤細(xì)胞株的建立.pdf

1、本研究利用帶有蘑菇凝素標(biāo)簽的原核表達(dá)載體(pET-LsLa)，將豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)M基因的胞內(nèi)區(qū)(99～227aa)插入載體，以期獲得能可溶性表達(dá)的、大量且易于純化的M蛋白。以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pET32a-PEDV(含S、M、N、ORF3基因)重組質(zhì)粒為模板，設(shè)計(jì)去除目的基因信號肽和含有酶切位點(diǎn)的特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因tM，構(gòu)建原核表達(dá)載體(pLsLa-

2、tM)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)、SDS-PAGE檢測及蛋白純化，結(jié)果顯示，融合蛋白LsLa-tM得到了大量表達(dá)，分子質(zhì)量約為36 kD，與預(yù)期大小致。包涵體形式產(chǎn)物通過2M乳糖親和層析純化得到純凈的目的蛋白(LsLa-tM)，Western blot檢測表明，純化蛋白能保持其反應(yīng)特異性。
　　以新生乳豬增殖PEDV流行毒株ZMDZY-CH-11，通過差速離心純化，得到純化的PEDV全病毒，用吸

3、光度測定法檢測其總蛋白含量約19 mg/mL。
　　利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的原核表達(dá)載體pGEX-PEDV-SA，在大腸桿菌BL21(DE3)中大量表達(dá)PEDV重組GST-SA蛋白，經(jīng)GST柱親和層析純化后得到目的蛋白，Western blot檢測表明該蛋白能和豬抗PEDV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。
　　將上述純化PEDV全病毒作為免疫原，免疫BALB/c小鼠，用純化的PEDV重組M蛋白作為檢測抗原;同時(shí)，以純化的PEDV重組GST

4、-SA蛋白作免疫原，免疫BALB/c小鼠，以純化的PEDV全病毒作檢測抗原，分別建立了檢測抗PEDV抗體的間接ELISA方法。
　　以PEDV重組M蛋白為檢測抗原時(shí)，確定檢測ELISA的最佳工作條件為:包被抗原量為1μg/孔/100μL，包被條件為4℃過夜，封閉物為5％脫脂奶，封閉時(shí)間為1.5 h，一抗稀釋度為1∶200，作用條件為37℃1.5h;酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1∶6000; TMB顯色時(shí)間為15 min。
　　以P

5、EDV全病毒為檢測抗原時(shí)，最終確定ELISA的最佳工作條件為:包被抗原量為0.5625μg/孔/100μL，包被條件為37℃作用1h后再4℃過夜;封閉物為5％脫脂奶，封閉時(shí)間為1 h;一抗稀釋度為1∶3200，作用條件為37℃1.5h;酶標(biāo)二抗最佳工作濃度為1∶8000;TMB顯色時(shí)間為15 min。
　　通過常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，用間接ELISA方法進(jìn)行檢測篩選，獲得分泌抗S蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞孔。將其采用有限稀釋法，進(jìn)行3～4

6、次亞克隆，最終獲得3株能穩(wěn)定分泌抗PEDV變異株S蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為2D1、1G6和2C10。單抗亞型鑒定均為IgM。間接ELISA檢測3株細(xì)胞培養(yǎng)上清中抗體效價(jià)分別為1∶1600、1∶800、1∶800，小鼠腹水中抗體效價(jià)分別為1∶6400、1∶3200、1∶3200。單抗特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，所制備的3株單抗與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病毒(PRV)及豬Ⅱ型圓環(huán)病毒(

7、PCV2)均無交叉反應(yīng)。
　　對其中一株(2D1)雜交瘤細(xì)胞的特性進(jìn)行Western blot，結(jié)果表明，該單克隆抗體能特異性識別PEDV，但不能區(qū)分PEDV流行株和PEDV CV777疫苗株。ELISA檢測中該單抗雖與PEDV流行株及PEDV CV777疫苗株全病毒都能反應(yīng)，但兩者的OD值有明顯差異，因此可用作鑒別PEDV流行株和疫苗株的初步篩選試驗(yàn)。采用硫氰酸鹽洗脫法測定該單抗相對親和力(Ka)為4.0 mol/L，表明該單抗