人乳鐵蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞株的建立.pdf

1、人乳鐵蛋白（Human Lactoferrin，hLF）是一種具有高級空間結(jié)構(gòu)的糖蛋白，具有廣泛的生物學(xué)作用。大量體內(nèi)體外試驗表明：hLF不僅在腸道鐵離子的吸收以及抵抗細(xì)菌、病毒、真菌、單細(xì)胞生物等方面具有重要作用，而且在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、調(diào)控基因表達(dá)及促進(jìn)骨骼生長方面也具有重要作用。因此，hLF在疾病防治、營養(yǎng)補充、食物或藥品的貯藏等方面具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為近幾年來研究的熱點之一，利用原核和真核表達(dá)系統(tǒng)已在生產(chǎn)重組hLF方面做了很多

2、嘗試.然而，還有很多問題尚待解決，如蛋白的表達(dá)水平較低、翻譯后的蛋白缺乏準(zhǔn)確的修飾及純化步驟復(fù)雜等，均致使這些方法不適合大規(guī)模的生產(chǎn)重組hLF。通過乳腺生產(chǎn)外源蛋白，具有成本低、分離純化簡單、可持續(xù)生產(chǎn)、不易污染及所表達(dá)的外源蛋白可進(jìn)行翻譯后加工、具有d然蛋白的結(jié)構(gòu)與活性等優(yōu)點，是生產(chǎn)基因工程藥物的理想場所。
　　 鑒于此，本研究構(gòu)建了hLF cDNA基因乳腺表達(dá)載體pGBC-hLF，此載體為隨機(jī)插入載體。為進(jìn)行載體的體外表達(dá)驗

3、證，在此載體中引入了Neo篩選基因，并在山羊乳腺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)驗證，為下一步制備穩(wěn)定整合有人乳鐵蛋白cDNA基因的山羊胎兒成纖維細(xì)胞提供試驗支撐；為了制備轉(zhuǎn)hLF cDNA基因的山羊胎兒成纖維細(xì)胞并提高轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的篩選效率，本研究在pGBC-hLF基礎(chǔ)上引入了新霉素基因（Neo）和增強綠色熒光蛋白（EGFP）基因作為篩選標(biāo)記，并利用條件培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，試驗發(fā)現(xiàn)這樣可有效縮短G418藥物作用時間，并可得到較純的

4、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；為了下一步獲得在基因組中定點整合有hLF cDNA基因的轉(zhuǎn)基因奶山羊，消除位置效應(yīng)對目的基因的表達(dá)影響，本試驗又構(gòu)建了人乳鐵蛋白的打靶載體pGBC5-hLF，并在山羊乳腺上皮細(xì)胞中進(jìn)行了載體的生物活性分析，為下一步實驗室制備hLF cDNA基因在山羊β-casein基因座定位整合的胎兒成纖維細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。
　　 本試驗的具體內(nèi)容如下：
　　 （1）構(gòu)建了人乳鐵蛋白（hLF）基因的乳腺表達(dá)載體pGBC-hLF，

5、F-Neo并驗證其在乳腺細(xì)胞中的表達(dá)情況。本載體以山羊β-casein基因上游包括啟動子、外顯子1、內(nèi)含子1、部分外顯子2作為5'端調(diào)控序列，下游包括部分外顯子7、內(nèi)含子7、外顯子8、內(nèi)含子8、外顯子9及3'部分基因組片段作為3'端調(diào)控序列，長度分別為6.2 kb和7.1 kb，將hLF基因（目的基因）和Neo基因（篩選標(biāo)記）分別插入到5'端調(diào)控序列和3'端調(diào)控序列的下游，構(gòu)建成pGBC-hLF-Neo載體，其全長為25.348 kb。

6、'為了檢測該載體的生物學(xué)功能，本試驗進(jìn)一步用脂質(zhì)體介導(dǎo)法將其分別導(dǎo)入到山羊乳腺上皮細(xì)胞GMC和小鼠乳腺上皮細(xì)胞株C127中進(jìn)行表達(dá)驗證，經(jīng)G418抗性篩選8-10 d，得到的抗性細(xì)胞克隆經(jīng)催乳素、胰島素及氫化可的松誘導(dǎo)培養(yǎng)，通過RT-PCR和WesternBlot檢測表明，本研究所構(gòu)建的hLF基因乳腺表達(dá)載體具有生物學(xué)活性，山羊β-casein基因啟動子驅(qū)動的hLF基因能夠在C127和GMC等乳腺上皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄翻譯，這為下一步建立穩(wěn)定整

7、合hLF基因奶山羊胎兒成纖維細(xì)胞奠定了基礎(chǔ)。
　　 （2）構(gòu)建了帶有雙標(biāo)記基因Neo和EGFP的乳腺表達(dá)載體pGBC-hLF-Neo-IRES2-EGFP，并通過酶切、PCR、測序鑒定了所構(gòu)建載體的完整性。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染山羊胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418抗性篩選7-10d后得到綠色熒光細(xì)胞克?。焕脝蝹€或多個表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞分離培養(yǎng)了轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，并通過試驗對比條件培養(yǎng)液和非條件培養(yǎng)液對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆形成效率的影響，結(jié)果證

8、明條件培養(yǎng)液更有利于陽性細(xì)胞克隆的形成。借助EGFP和Neo基因作為雙篩選標(biāo)記，可有效的縮短轉(zhuǎn)基因細(xì)胞在G418藥物中的培養(yǎng)時間，提高了陽性克隆細(xì)胞的篩選效率。嘗試了利用多重PCR鑒定了表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組中的整合情況，避免了單基因PCR導(dǎo)致的假陽性問題；建立了轉(zhuǎn)hLF基因山羊胎兒成纖維細(xì)胞，為以后核移植技術(shù)生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因克隆動物所需的供體細(xì)胞的制備提供了一種參考體系。
　　 （3）構(gòu)建了人乳鐵蛋白基因的β-casein基因座

9、的定點打靶載體，此載體以β-casein上游包括啟動子，外顯子1、內(nèi)含子1及部分外顯子2的6.3kb的調(diào)控序列作為5'同源長臂，以下游2.4 kb的序列包括外顯子8和9作為3'同源短臂，Neo基因和tk基因分別作為正負(fù)篩選基因，并在Neo基因兩端分別加上正向重復(fù)序列l(wèi)oxp序列；將人乳鐵蛋白基因（hLF）克隆到5'同源長臂下游，Neo克隆到β-casein基因7、8外顯子之間，tk基因克隆到3'同源短臂外側(cè)并用原核序列進(jìn)行保護(hù)；經(jīng)克隆重