大豆鐵蛋白基因的克隆、表達載體的構建及對擬南芥的轉化.pdf

1、鐵缺乏是世界范圍內人類面臨的嚴重營養(yǎng)問題。在禾谷類作物中表達豆類鐵蛋白,以增加食物中的鐵攝入量,是改良食品中鐵含量的一個理想途徑。本實驗以ncbi數據庫獲得已知豆類鐵蛋白序列為模板,借助軟件Prime5.0進行引物設計,通過反轉錄方法從豫豆8號中克隆到cDNA片段,測序結果表明該基因cDNA全長752bp；利用DNAMAN軟件進行序列比對分析發(fā)現(xiàn)該序列與大豆(M64337)鐵蛋白同源性高達98％以上,編碼250氨基酸。運用生物信息學軟件

2、及相關網站對其功能位點、結構功能域分析,結果顯示該基因具有1個FER-RITIN-LIKE功能域,2個鐵蛋白基因家族鐵結合區(qū)域的信號序列,6個磷酸化位點等重要功能位點。
　　 本研究表達載體采用Gateway重組克隆技術構建,目標基因連入pGWC后即為入門克隆(Entry Clone),通過與表達載體做LR反應構建目標基因的表達載體。通過抗性篩選、PCR檢測證實大豆鐵蛋白ferritin基因植物表達載體構建成功。通過農桿菌電擊轉

3、化的方法將表達載體PLEELA轉入農桿菌pMP90RK中。
　　 利用農桿菌介導的花粉管通道法將大豆鐵蛋白ferritin基因導入擬南芥植株,獲得抗除草劑抗性的植株,提取抗性植株葉片DNA對其進行PCR檢測,鑒定結果是四株為陽性,初步證實大豆鐵蛋白基因已經整合進擬南芥基因組中。
　　 本研究對大豆鐵蛋白基因的克隆、植物表達載體的構建及對擬南芥的轉化,為進一步研究大豆鐵蛋白ferdtin基因的功能和利用該基因進行禾谷類作物