高山離子芥鐵蛋白基因CbFer的克隆、表達(dá)及其抗氧化功能分析.pdf

1、高山離子芥(Chorispora bungeana Fisch.&C.A.Mey)是一種稀有的高山冰緣植物，具有很強(qiáng)抗寒能力，它不具備特殊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，但在生理和分子水平上是研究植物適應(yīng)冷凍環(huán)境機(jī)制的理想材料。本文以高山離子芥為實(shí)驗(yàn)材料，克隆到一個(gè)全新的鐵蛋白基因(CbFer)，在不同溫度下(4℃、0℃和．4℃)對(duì)其進(jìn)行低溫脅迫后，系統(tǒng)性的檢測(cè)了AsA-GSH系統(tǒng)和CbFer基因?qū)Φ蜏氐捻憫?yīng)表達(dá)，重點(diǎn)對(duì)誘導(dǎo)CbFer基因表達(dá)的信號(hào)途徑進(jìn)行

2、了初步研究。結(jié)果認(rèn)為高山離子芥作為高山冰緣植物所特有的抗寒機(jī)制主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面： 1、高山離子芥鐵蛋白基因(CbFer)全長(zhǎng)975bp，有一個(gè)編碼260個(gè)氨基酸的開放閱讀框(ORF)。對(duì)應(yīng)編碼的蛋白分子量為29.17 kDa，等電點(diǎn)是5.44。在氨基酸結(jié)構(gòu)域分析中，揭示了高山離子芥鐵蛋白有類似鐵蛋白雙鐵結(jié)構(gòu)域并且具有鐵蛋白鐵結(jié)合區(qū)域的特征。 2、CbFer cDNA編碼的鐵蛋白亞基含有一段定位于葉綠體蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。

3、RT-PCR分析表明這個(gè)基因是組織特異性表達(dá)的基因，只能在葉片中檢測(cè)到它的表達(dá)。這表明CbFer基因編碼的鐵蛋白功能在葉片中發(fā)揮。 3、檢測(cè)這個(gè)基因在冷凍脅迫(4℃、0℃和-4℃)下的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)它的轉(zhuǎn)錄物在4℃逐漸積累，而在0℃和-4℃的積累反而直接和迅速。這表明CbFer基因的表達(dá)與溫度密切相關(guān)、對(duì)溫度反應(yīng)敏感，所以CbFer基因的表達(dá)是高山離子芥?zhèn)鬟f抵御低溫脅迫信號(hào)的一個(gè)重要保護(hù)機(jī)制。隨著脅迫強(qiáng)度的增大，植物啟動(dòng)這個(gè)保護(hù)

4、機(jī)制就越迅速。這恰恰就反映了高山離子芥具有適應(yīng)溫度劇烈變化的能力。 4、鐵鰲合劑(Ferrozine)處理明顯的抑制了CbFer基因的表達(dá)，表明鐵是調(diào)控CbFer基因表達(dá)的一個(gè)重要限制因子。但值得注意的是經(jīng)鐵鰲合劑處理后再進(jìn)行冷凍脅迫又可以重新誘導(dǎo)CbFer基因的表達(dá)。這說(shuō)明在冷凍情況下誘導(dǎo)CbFer表達(dá)的信號(hào)除了鐵這個(gè)因素以外還可能包含其他因素。 5、用外源信號(hào)處理發(fā)現(xiàn)：過量鐵和H<,2>O<,2>正調(diào)控CbFer基因

5、的表達(dá)；ABA負(fù)調(diào)控CbFer基因的表達(dá)；SNP處理不能引起CbFer基因表達(dá)的變化。鐵鰲合劑處理后引起的CbFer基因的表達(dá)抑制不能被外源ABA、Fe、SNP處理所恢復(fù)。但在同樣情況下，用H<,2>O<,2>處理在一定程度上誘導(dǎo)了CbFer的表達(dá)。這表明CbFer基因表達(dá)不受ABA、NO作用，但受H202氧化，部分解除抑制使基因重新表達(dá)。 6、對(duì)高山離子芥蛋白水平的分析表明，鐵蛋白含量隨著溫度的降低升高，增強(qiáng)了植物在冷凍脅迫下

6、加速轉(zhuǎn)換Fe<'2+> Fe<'3+>的能力，限制了OH產(chǎn)生。 7、在低溫處理過程中我們還發(fā)現(xiàn)高山離子芥抗寒性體現(xiàn)在AsA-GSH系統(tǒng)的幾種酶活性上：其中SOD和CAT這兩種直接清除活性氧的酶表現(xiàn)相同的變化趨勢(shì)，隨著溫度的降低，酶活性反而升高；AsA-POD是葉綠體中清除H<,2>O<,2>的主要酶類，4℃和0℃處理時(shí)酶活性升高，0℃處理時(shí)酶活性明顯高于4℃，但在-4℃時(shí)酶活性的變化近似于對(duì)照水平；DHAR酶活性一直保持在較平

7、穩(wěn)的、高于對(duì)照水平上；MDHAR和GR作為AsA-GSH系統(tǒng)的動(dòng)力酶在低溫脅迫過程中保持了較高活性，為其他酶提供了足夠的動(dòng)力。高山離子芥存在的這種對(duì)溫度敏感的快速清除活性氧系統(tǒng)，與CbFer基因?qū)囟确磻?yīng)敏感結(jié)果一致，一旦低于正常生長(zhǎng)溫度，酶保護(hù)系統(tǒng)與CbFer基因同步運(yùn)作，這正是酶系統(tǒng)與CbFer基因表達(dá)的同步協(xié)調(diào)表達(dá)的結(jié)果。使高山離子芥在低溫脅迫過程中的活性氧水平一直處于較低水平，保護(hù)植物免受膜脂過氧化的傷害。 我們認(rèn)為高山

8、離子芥能夠在低溫環(huán)境中正常生長(zhǎng)，是通過CbFer基因的表達(dá)、快速啟動(dòng)AsA-GSH系統(tǒng)二者協(xié)同作用來(lái)實(shí)現(xiàn)的。酶活性提高加速抗氧化系統(tǒng)的運(yùn)行清除活性氧：鐵蛋白的增加，吸收：Fe<'2+>，減少羥自由基的生成而起到減輕膜損傷的保護(hù)作用。AsA-GSH抗氧化系統(tǒng)和鐵蛋白協(xié)同作用，減少了Fenton反應(yīng)所需的兩個(gè)必需的底物(H<,2>O<,2>和Fe<'2+>)，從而減少了羥自由基的產(chǎn)生，減少了膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，由此保護(hù)高山離子芥抵御