超順磁氧化鐵標(biāo)記對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和鐵蛋白輕鏈基因及蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、研究背景：
　　 近年來(lái),干細(xì)胞移植是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn),在修復(fù)損傷組織如心肌梗塞和腦組織、血管再通以及糖尿病治療等方面具有十分誘人的前景。進(jìn)行干細(xì)胞移植,首先需要獲得足夠的干細(xì)胞來(lái)源。在臨床應(yīng)用性較好的干細(xì)胞中,研究較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchyme stem cells,BMSCs)和胚胎干細(xì)胞(Embryonic Stem cells,ESCs)。BMSCs來(lái)源不足(每個(gè)成人只能抽取10-2

2、0ml骨髓)、抽取骨髓有創(chuàng)等缺點(diǎn)。ESCs不僅存在免疫排斥的問(wèn)題,還涉及倫理學(xué)的問(wèn)題。因此急需尋找一種來(lái)源充分、易被患者接受的干細(xì)胞來(lái)源。2001年,Zuk等從人抽脂術(shù)中抽取的脂肪組織懸液中第一次成功分離取得了脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose tissue-derived mescnchymal stem cells,ADSCs),為干細(xì)胞的來(lái)源提供了新的選擇,脂肪干細(xì)胞的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。干細(xì)胞移植入活體動(dòng)物后,需要準(zhǔn)確了解移

3、植干細(xì)胞在體內(nèi)遷徙、歸巢、增殖及分化,這樣才能評(píng)價(jià)移植療效、優(yōu)化移植方法及選擇合適的移植窗口期。但是觀察干細(xì)胞移植后在體內(nèi)微環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)化、生存狀況一直是困擾學(xué)者的一大難題。傳統(tǒng)研究方法是處死動(dòng)物后取得組織做病理檢查,此種方法不能滿足臨床應(yīng)用的需求,且處死動(dòng)物后進(jìn)行離體觀察,結(jié)果不能真實(shí)、準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞在活體內(nèi)的生存狀況。
　　 超順磁氧化鐵(Supraparamagnetic iron oxide,SPIO)納米微粒標(biāo)記干細(xì)

4、胞,然后用MRI能無(wú)創(chuàng)、在體示蹤細(xì)胞,是最具前景的方法之一。Arbab等研究證實(shí),SPIO標(biāo)記干細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)的鐵濃度會(huì)較未標(biāo)記細(xì)胞增加數(shù)十至百倍。細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的維持(Cellular iron homeostasis)在細(xì)胞生命活動(dòng)中極其重要；如果細(xì)胞內(nèi)鐵超載時(shí),可以潛在誘導(dǎo)氧自由基的生成,導(dǎo)致細(xì)胞損傷。因此,了解標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)如何維持和調(diào)節(jié),是SPIO標(biāo)記干細(xì)胞研究方面所必需重視的課題。維持細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的最重要的系統(tǒng)為鐵調(diào)節(jié)蛋白/

5、鐵反應(yīng)元件系統(tǒng)(IronRegulatory Proteins/Iron Responsive Elements System,IRPs/IREs系統(tǒng)),此系統(tǒng)包括:轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Transferrin Receptor,TfR)、鐵蛋白(Ferritin,Fn)和鐵調(diào)節(jié)蛋白(Iron Regulatory Proteins,IRPs),它們共同參與細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)的維持,其中TfR和Fn的表達(dá)均受IRPs在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控。IRPs通過(guò)

6、與TfR和Fn mRNA上的高度保守的非翻譯區(qū)(Untranslated Region,UTR)作用得以實(shí)現(xiàn)調(diào)控功能。TfR和Fn mRNA的UTR與IRPs相結(jié)合的位點(diǎn)被稱為鐵反應(yīng)元件(Iron ResponseElements,IREs)。SPIO標(biāo)記干細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵超載,細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)能否得以維持?Pawelczyk等研究發(fā)現(xiàn),使用轉(zhuǎn)染劑硫酸魚(yú)精蛋白介導(dǎo)SPIO標(biāo)記干細(xì)胞時(shí),細(xì)胞內(nèi)的TfR mRNA和蛋白表達(dá)水平暫時(shí)性減低,而F

7、n的mRNA和蛋白表達(dá)水平保持不變。但Schafer等用流式細(xì)胞技術(shù)檢驗(yàn)了CD71(即轉(zhuǎn)鐵蛋白受體),認(rèn)為使用轉(zhuǎn)染劑介導(dǎo)SPIO標(biāo)記干細(xì)胞對(duì)干細(xì)胞的基因表達(dá)無(wú)影響,但他們未對(duì)TfR的mRNA和蛋白水平進(jìn)行定量研究；如果不用轉(zhuǎn)染劑直接對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行SPIO標(biāo)記,則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的TfR表達(dá)上調(diào)。在SPIO標(biāo)記時(shí),細(xì)胞內(nèi)IRPs/IREs系統(tǒng)各蛋白的基因和蛋白表達(dá)情況動(dòng)態(tài)變化如何?還有待于進(jìn)一步研究探討。因此,本實(shí)驗(yàn)使用轉(zhuǎn)染劑左旋多聚賴氨酸(PL

8、L)介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠脂肪干細(xì)胞,初步探討該標(biāo)記方法對(duì)大鼠脂肪干細(xì)胞 TfR和Fn基因及蛋白表達(dá)的影響。
　　 研究目的：
　　 1、建立大鼠ADSCs細(xì)胞的體外原代分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定的實(shí)驗(yàn)方法。
　　 2、研究轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠ADSCs細(xì)胞的可行性及對(duì)干細(xì)胞活力和細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 3、研究轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠ADSCs細(xì)胞對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體及鐵蛋白基因及蛋白

9、表達(dá)的影響。
　　 材料與方法：
　　 1、大鼠ADSCs細(xì)胞的原代分離、培養(yǎng)、傳代及鑒定。取3-4周齡SD大鼠,無(wú)菌條件下切取其腹股溝處脂肪組織,切除肉眼可見(jiàn)的小血管和筋膜,充分剪碎脂肪組織,加入兩倍體積的0.25％Ⅱ型膠原酶溶液,37℃消化30-45min,加入適量低糖DMEM+10％胎牛血清完全培養(yǎng)基中和酶活性,1500rpm離心10min后棄上清和未消化組織,最后加入低糖DMEM+10％FBS重懸細(xì)胞,移入培養(yǎng)瓶

10、培養(yǎng)。倒置顯微鏡動(dòng)態(tài)觀察干細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程,待貼壁細(xì)胞近鋪滿瓶底70-80％時(shí),可以用含EDTA的胰酶消化,進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取第3代細(xì)胞繪制第1-7天的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。并用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表面抗原CD29、CD31、CD34及CD44的表達(dá)情況。
　　 2、轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠ADSCs細(xì)胞的可行性及其對(duì)干細(xì)胞活力和增殖能力的影響。本試驗(yàn)使用第三代干細(xì)胞(P3),所用SPIO試劑為Resovist(Schering,B

11、erlin,Germany),原始濃度為28mg/ml。PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記干細(xì)胞方法:無(wú)血清培養(yǎng)基按比例加入SPIO和PLL,室溫下置于搖床混勻30min(30r/min)；加入有貼壁干細(xì)胞且鋪滿瓶底約90％的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),37℃、5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h；PBS洗滌標(biāo)記細(xì)胞3次,除去多余SPIO待用。標(biāo)記后細(xì)胞經(jīng)過(guò)普魯士蘭染色,用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞標(biāo)記鐵的情況。將濃度分別為0、12.5、25、50、75μg/mlSPIO加入六孔培養(yǎng)

12、板各孔中與PLL及干細(xì)胞共培養(yǎng)12h后,用臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活性。將0及50μg/ml濃度的SPIO加入六孔培養(yǎng)板與PLL及干細(xì)胞共培養(yǎng),分別在標(biāo)記后第1、3、5、7、9天進(jìn)行MTT試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。
　　 3、轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠ADSCs細(xì)胞對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體及鐵蛋白基因及蛋白表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)采用轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠ADSc細(xì)胞,分別在標(biāo)記前0h、標(biāo)記后第2h、4h、8h、16h、24h、

13、4d、1w、2w、3w、4w用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,然后配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液,以37℃15min,85℃5sec的反應(yīng)條件進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),獲得cDNA。測(cè)定cDNA的濃度,依據(jù)濃度比例按試劑說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)液,進(jìn)行兩步法實(shí)時(shí)定量PCR。依所得的CT值定量計(jì)算在上述不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和鐵蛋白輕鏈mRNA的表達(dá)量。另分別在標(biāo)記前0h、標(biāo)記后16h、24h、4d、1w、2w、3w、4w用裂解液和蛋白酶抑制劑提取細(xì)胞總蛋白,并用B

14、CA法測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的蛋白濃度,進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn),其步驟大致如下:①變性、還原蛋白,②制備聚丙稀酞胺凝膠,③蛋白上樣,④電泳,⑤轉(zhuǎn)膜,⑥麗春紅染色,⑦封閉PVDF膜的免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn),⑧洗膜,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,⑨ECL顯示,并用膠片曝光。將所得結(jié)果用掃描儀掃描,用Molecular Analysis圖象分析軟件定量分析上述不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和鐵蛋白輕鏈蛋白表達(dá)結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　

15、 1、運(yùn)用25％Ⅱ型膠原酶消化大鼠脂肪的方法,能夠在體外成功分離培養(yǎng)出大鼠脂肪干細(xì)胞。原代培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)呈多形性,隨著培養(yǎng)時(shí)間和傳代次數(shù)的增加所得到的細(xì)胞形態(tài)變得比較均一,呈梭形。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線顯示細(xì)胞增生活躍。對(duì)第4代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè),發(fā)現(xiàn)98％的細(xì)胞表達(dá)CD29,97％的細(xì)胞表達(dá)CD44,而只有5％的細(xì)胞表達(dá)CD34,這一結(jié)果符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征。
　　 2、轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO能簡(jiǎn)單、高效的標(biāo)記大鼠ADSCs細(xì)胞

16、,在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)干細(xì)胞活力及增殖能力無(wú)明顯不可逆影響。普魯士藍(lán)染色證實(shí)SPIO標(biāo)記大鼠脂肪干細(xì)胞胞后,細(xì)胞漿內(nèi)有多少不等的藍(lán)染鐵顆粒。SPIO的濃度分別為12.5、25、50、75μg/ml時(shí),光學(xué)顯微鏡下觀察標(biāo)記組細(xì)胞標(biāo)記率達(dá)100％時(shí)間分別為48h、36h、24h、12h,可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)鐵顆粒的濃度隨孵育時(shí)間、標(biāo)記濃度的增加而增加。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SPIO濃度分別為12.5、25、50、75μg/ml時(shí),經(jīng)單向方差分析

17、,各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義(F=1.512,P=0.271)。MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,在1d,3d,5d,7d,9d分別測(cè)吸光光度值發(fā)現(xiàn)在標(biāo)記后第1d(t=2.798,P=0.049)和第3d(t=3.164,P=0.034),標(biāo)記組細(xì)胞增殖能力略低于未標(biāo)記組；在第5d(t=1.867,P=0.135),7d(t=2.671,P=0.056),9d(t=0.979,P=0.383)標(biāo)記組和未標(biāo)記組細(xì)胞增殖能力之間差異無(wú)顯著性意義(

18、P>0.05)。
　　 3、轉(zhuǎn)染劑PLL介導(dǎo)SPIO標(biāo)記大鼠ADSCs后,Fn-L基因及蛋白表達(dá)水平會(huì)暫時(shí)性升高,TfR基因表達(dá)水平會(huì)暫時(shí)降低而蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯改變。Fn-LmRNA表達(dá)見(jiàn)表1。TfR mRNA表達(dá)見(jiàn)表2。接著,我們用Western Blot實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和鐵蛋白輕鏈的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了定量檢測(cè),Fn-L蛋白表達(dá)見(jiàn)表3；TfR蛋白表達(dá)在標(biāo)記與未標(biāo)記組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性意義(F=3.555,P

19、=0.132)。
　　 兩均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析
　　 組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)之間均數(shù)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析
　　 結(jié)論：
　　 本研究表明在體外運(yùn)用膠原酶消化大鼠脂肪,能夠分離培養(yǎng)出大鼠ADSCs,具有可行性,且獲得的細(xì)胞表型較均一,增殖能力活躍。運(yùn)用轉(zhuǎn)染及PLL介導(dǎo)SPIO可以簡(jiǎn)單、高效的標(biāo)記大鼠ADSCs,且在一定的濃度范圍內(nèi),對(duì)標(biāo)記后細(xì)胞的活力及增殖能力無(wú)明顯不可逆的影響。在一定濃度范圍內(nèi),PL