團(tuán)頭魴鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在嗜水氣單胞菌感染過(guò)程中的免疫功能研究.pdf

1、鐵是生物體不可缺少的微量元素，在多種生理活動(dòng)中都發(fā)揮著重要作用，然而鐵過(guò)剩不僅會(huì)刺激機(jī)體產(chǎn)生有害的自由基，還會(huì)利于體內(nèi)病原微生物的增殖。因此，維持機(jī)體鐵穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，其中鐵蛋白（Ferritin，F(xiàn)T）和轉(zhuǎn)鐵蛋白（Transferrin，TF）分別作為鐵儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白而發(fā)揮著關(guān)鍵作用。一直以來(lái)，鐵是細(xì)菌和宿主爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)源的核心，許多鐵代謝相關(guān)基因都會(huì)參與宿主的先天性免疫反應(yīng)。近年來(lái)，鐵代謝通路的免疫功能研究越來(lái)越受關(guān)注，相關(guān)報(bào)道也逐漸增多

2、。團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）作為我國(guó)的一種大宗淡水魚(yú)類，近年來(lái)由于集約化養(yǎng)殖和環(huán)境惡化等原因?qū)е露喾N病害頻發(fā)，其中以嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）感染引發(fā)的細(xì)菌性敗血癥尤為嚴(yán)重。本研究以團(tuán)頭魴為研究對(duì)象，對(duì)其Ft（M.amblycephala ferritins，MamFers）和Tf(M.amblycephala transferrin，MamTf)基因進(jìn)行了克隆、表達(dá)及

3、重組蛋白活性檢測(cè)，并在L8824細(xì)胞上過(guò)表達(dá)后進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序及差異基因篩選，最后實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MamFers和MamTf對(duì)鐵代謝和免疫通路的調(diào)控作用，旨在探索MamFers和MamTf基因在鐵代謝和免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮的作用，為魚(yú)類細(xì)菌性疾病的預(yù)防和治療及抗病育種提供理論依據(jù)。本文主要研究結(jié)果如下:
　　1.本研究克隆鑒定了團(tuán)頭魴Ft基因兩個(gè)亞基(M.amblycephala ferritin Hand Msubunits，MamF

4、erH和MamFerM)，序列分析表明這兩個(gè)亞基都含有哺乳動(dòng)物鐵蛋白H亞基的鐵氧化酶活性中心結(jié)構(gòu)，而且MamFerM還含有哺乳動(dòng)物鐵蛋白L亞基的成核作用位點(diǎn)。MamFerH和MamFerM的5非編碼區(qū)(5'-Untranslated Regions，5'-UTR)都含有鐵反應(yīng)元件(Iron Responsive Element,IRE)元件，但預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在差異。序列比對(duì)分析表明MamFerH和MamFerM間的同源性僅有65％，并

5、且進(jìn)化分析表明鐵蛋白H和M亞基分別聚為一支，表明兩者由不同的基因編碼而成。MamFerH和MamFerM具有類似的早期發(fā)育表達(dá)模式，都在出膜后表達(dá)上調(diào)。然而，MamFerH和MamFerM具有不同的組織表達(dá)模式，MamFer主要表達(dá)于血液和腦，而MamFerM則在脾臟、肝臟和腎臟中高表達(dá)。嗜水氣單胞菌感染后，MamFerH和MamFerM在mRNA和蛋白水平都能被誘導(dǎo)而顯著上調(diào)表達(dá)，免疫組化和免疫熒光分析表明感染后兩者在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核上

6、的分布都會(huì)顯著增強(qiáng)，其中MamFerH具有更快速和更顯著的急性期反應(yīng)。相比之下，重組MamFerH蛋白也表現(xiàn)出更有效的抑菌作用，而重組MamFerM蛋白則具有更有效的鐵結(jié)合活性。
　　2.本研究還克隆了MamTf基因，MamTf蛋白由兩個(gè)同源結(jié)構(gòu)域（N端和C端）組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域都含有4個(gè)鐵離子結(jié)合位點(diǎn)。MamTf在團(tuán)頭魴肝臟中特異性高表達(dá)，表達(dá)水平顯著高于其他組織。發(fā)育期表達(dá)分析顯示MamTf在12 hpf(hours post

7、fertilization)開(kāi)始表達(dá)并逐漸上調(diào)，隨后在出膜期(32 hpf)顯著下調(diào)，出膜后在2 dph(days post hatching)顯著上調(diào)并達(dá)到最大值。嗜水氣單胞菌感染后MamTf及其受體1在團(tuán)頭魴肝、脾、腎3個(gè)組織中的mRNA和蛋白表達(dá)水平都被誘導(dǎo)上調(diào)。普魯士藍(lán)染色顯示感染后肝細(xì)胞內(nèi)的鐵含量顯著增多，免疫組化分析表明感染后MamTf及其受體1在肝細(xì)胞膜和胞內(nèi)分布增多，表明兩者可能通過(guò)內(nèi)在化將鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，致使團(tuán)頭魴肝

8、細(xì)胞內(nèi)鐵含量上調(diào)。重組MamTf蛋白的鐵結(jié)合活性呈現(xiàn)出濃度依賴性上升方式，并且體外實(shí)驗(yàn)表明添加重組MamTf蛋白可以在一定程度上抑制嗜水氣單胞菌的增殖。
　　3.為進(jìn)一步研究MamFers和Mam Tf基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，本研究在L8824細(xì)胞中過(guò)表達(dá)MamFerH、MamFerM和MamTf后進(jìn)行數(shù)字表達(dá)譜測(cè)序。比較數(shù)字表達(dá)譜分析表明MamFerH和MamFerM的下游調(diào)控通路包括免疫系統(tǒng)及抗菌反應(yīng)，qRT-PCR（Quanti

9、tative Real-time Polymerase Chain Reaction）驗(yàn)證表明MamFers和MamTf過(guò)表達(dá)后分別能誘導(dǎo)TNFα(Tumor Necrosis Factor alpha)和iNOS（Inducible Nitric Oxide Synthase）基因表達(dá)上調(diào)。NFκB(Nuclear Factorκ B)作為一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，廣泛參與機(jī)體免疫應(yīng)答，包括對(duì)多種細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)Mam

10、Fers和MamTf過(guò)表達(dá)后能促進(jìn)NFκB的轉(zhuǎn)錄活性及pIKK蛋白磷酸化水平的上調(diào)。添加BAY11-7082（IκBα抑制劑）會(huì)顯著抑制MamFers和Mam Tf過(guò)表達(dá)后對(duì)細(xì)胞因子的誘導(dǎo)表達(dá)作用。此外，本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過(guò)表達(dá)后也能顯著上調(diào)MAPK(Mitogen-activated ProteinKinase)蛋白的磷酸化水平，添加U0126（MEK1/2抑制劑）會(huì)顯著抑制MamFers和Mam Tf過(guò)表達(dá)后對(duì)促炎

11、細(xì)胞因子的誘導(dǎo)表達(dá)作用。上述結(jié)果表明，MAPK和NFκB能介導(dǎo)MamFers和MamTf對(duì)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)調(diào)控。
　　4.本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過(guò)表達(dá)會(huì)抑制嗜水氣單胞菌Ah對(duì)EPC細(xì)胞的粘附，而干擾后會(huì)促進(jìn)Ah的粘附過(guò)程。qRT-PCR分析表明MamFers和MamTf過(guò)表達(dá)后ECM(Extracellular Matrixc)相關(guān)基因fibronectin(FN)和Integrinbeta1(Intgβ1)表達(dá)都

12、會(huì)被調(diào)控。然而兩者具有截然相反地調(diào)控方式，MamFers和MamTf過(guò)表達(dá)后FN表達(dá)上調(diào)而Intgβ1下調(diào)，MamFers和MamTf干擾后表達(dá)趨勢(shì)相反。進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)N和Intgβ1都參與了介導(dǎo)MamFers和MamTf對(duì)Ah粘附過(guò)程的調(diào)控。
　　5.本研究發(fā)現(xiàn)MamFers和MamTf過(guò)表達(dá)會(huì)促進(jìn)NLRC5(NOD-like ReceptorFamily CARD Domain Containing5)、β2M(β2 Mi

13、croglobulin)和MHCⅠ（MajorHistocompatibility Complex ClassⅠ）表達(dá)上調(diào)。本研究將siRNA-NLRC5與MamFers和Mam Tf過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后可以顯著抑制MamFers和MamTf對(duì)β2M/MHCⅠ表達(dá)的誘導(dǎo)作用，表明MamFers和Mam Tf可以通過(guò)NLRC5調(diào)控β2M/MHCⅠ的表達(dá)。此外，MamFers和Mam Tf過(guò)表達(dá)會(huì)顯著促進(jìn)hepcidin基因表達(dá)上調(diào)，而siR