鐵蛋白基因FTH1慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建及在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、背景與目的：
　　 隨著分子影像學(xué)在基因治療中應(yīng)用范圍的不斷擴(kuò)展，磁共振報告基因成像已經(jīng)成為目前研究的熱點。大量的研究已證實了磁共振報告基因成像的可行性及其優(yōu)勢。MR報告基因成像成功克服了磁探針在細(xì)胞內(nèi)會隨著細(xì)胞的增殖而逐漸降解的缺點，可以在基因治療過程中對基因的表達(dá)及療效進(jìn)行動態(tài)監(jiān)視。選擇一種有效、穩(wěn)定、安全的報告基因是磁共振報告基因成像的前提。在眾多的磁共振報告基因中，能夠通過利用內(nèi)源性鐵實現(xiàn)MR成像的主要有鐵蛋白基因和ma

2、gA基因，前期研究中我們利用magA基因作為磁共振報告基因進(jìn)行了初步的體外轉(zhuǎn)鐵實驗，發(fā)現(xiàn)magA基因雖然能夠轉(zhuǎn)鐵，但其轉(zhuǎn)鐵量尚不足以引起MR信號的改變。本研究通過已知基因序列克隆FTH1基因，將載有FTH1基因的慢病毒質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中，研究FTH1基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，為進(jìn)一步實現(xiàn)報告基因成像過程中的基因調(diào)控奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1 FTH1基因片段的PCR擴(kuò)增及鑒定根據(jù)FTH1基因的克隆模板序

3、列(BC000857)，設(shè)計合成PCR引物（FTH1-F:5'-GGAATTCATGACGACCGCGTCCACC-3'和口 FTH1-R:5'-TTTGCGGCCGCTTAGCTTTCATTAT-3'），利用PCR擴(kuò)增技術(shù)對FTH1基因的CDS區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增，獲得大量有效的FTH1基因片段，通過酶切鑒定和基因序列測定分析目的基因序列的準(zhǔn)確性。
　　 2 FTH1慢病毒載體構(gòu)建用EcoRⅠ、NotⅠ雙切酶體系對擴(kuò)增后的FTH1基因

4、片段和pLenO-GFP慢病毒載體進(jìn)行雙酶切，膠回收技術(shù)對酶切后的目的基因和空載病毒載體進(jìn)行回收，利用DNA連接酶將pLenO-GFP載體DNA和FTH1基因DNA片段連接在一起，經(jīng)大腸桿菌進(jìn)行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化，通過PCR及酶切鑒定目的基因與載體連接的準(zhǔn)確性。
　　 3重組慢病毒的包裝制備將包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒和重組后的pLenO-GFP-FTH1依據(jù)相關(guān)條件共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，用熒光顯微鏡觀察293 T細(xì)胞的熒光表達(dá)情況，收集細(xì)

5、胞上清液，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測pLenO-GFP-FTH1滴度。
　　 4 FTH1基因轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞及在細(xì)胞中的表達(dá)將pLenO-GFP-FTH1慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SK-N-SH)，分別于24h和48h在熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，利用流式細(xì)胞分選技術(shù)，篩選出高表達(dá)GFP的細(xì)胞株。將FTH1/SK-N-SH細(xì)胞株傳至4代后，在培養(yǎng)基中加入濃度為500μmol/L的枸櫞酸鐵進(jìn)行培養(yǎng)，并將同代未轉(zhuǎn)染病毒的腫瘤細(xì)胞作為

6、對照組進(jìn)行同等條件的培養(yǎng)。利用普魯士藍(lán)染色及電鏡技術(shù)分別觀察細(xì)胞質(zhì)的變化情況，檢測FTH1在腫瘤細(xì)胞中的轉(zhuǎn)鐵效應(yīng)。臺盼藍(lán)試驗檢測細(xì)胞活性。
　　 結(jié)果:
　　 1 pLenO-GFP-FTH1重組質(zhì)粒的鑒定酶切鑒定和基因序列測定證實已成功構(gòu)建pLenO-GFP-FTH1，測得目的基因序列與基因庫中的FTH1序列一致。
　　 2 FTH1慢病毒包裝及滴度測定在病毒包裝過程中，用熒光顯微鏡觀察293 T細(xì)胞內(nèi)有大量的

7、綠色熒光顯示。用0.1μL GFP-FTH1慢病毒感染293 T細(xì)胞后，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測熒光表達(dá)效率＞85％，病毒滴度約為8.9×108 TU/ml。
　　 3 FTH1基因感染神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞慢病毒感染SK-N-SH細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察靶細(xì)胞內(nèi)有大量綠色熒光顯示，且經(jīng)4次傳代后靶細(xì)胞內(nèi)仍可見大量綠色熒光，證實FTH1成功轉(zhuǎn)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中并能在細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。
　　 4 FTH1在靶細(xì)胞中的表達(dá)普魯士藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)試驗