SMAC基因干擾慢病毒載體的構建及其在晶狀體上皮細胞的表達.pdf

1、白內障是世界范圍主要的致盲眼病，據預測到2020年每年會有2000-2500萬患者需行白內障手術。這無疑會對社會和國家造成巨大的經濟負擔。因此，探求白內障的發(fā)病因素及發(fā)病機理，延緩和阻止白內障發(fā)生及發(fā)展顯得尤為重要。國內外醫(yī)學工作者尤其是眼科工作者為此做出了巨大的努力，并取得了令人矚目的成績。近年來越來越多的證據表明晶狀體上皮細胞(Lensepithelialcells，LECs)凋亡可能是各種非先天性白內障形成的細胞學基礎。因此，檢測

2、年齡相關性白內障患者晶狀體上皮細胞凋亡發(fā)生的分子機制，抑制晶狀體上皮細胞的凋亡過程，為延緩和阻止年齡相關性白內障的發(fā)生和發(fā)展提供了新的思路。
　　線粒體蛋白Smac/DIABLO(secondmitochondrialactivatorofcaspase/directIAPbindingproteinwithlowPI)，被稱為第二線粒體來源的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活劑，是一種存在于線粒體并且調節(jié)細胞凋亡的蛋白質。既往研究顯

3、示在年齡相關性白內障中Smac可能參與了晶狀體上皮細胞的凋亡過程以及白內障的形成。因此，如果能特異性沉默Smac基因，觀察其下調前后晶狀體上皮細胞內凋亡的變化，對白內障發(fā)病機制的研究具有重要意義。
　　RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是指在生物體內，內源性或外源性的雙鏈RNA(double.strandedRNA，dsRNA)引起與其同源的mRNA特異性降解，導致轉錄后階段的基因沉默。dsRNA經酶切后會形成

4、很多小片段siRNA(SmallinterferingRNA，siRNA)，這些小片段siRNA是一種小RNA分子，一旦與信使RNA(mRNA)中的互補序列互相結合，會導致整條mRNA失去翻譯成蛋白質的功能，RNA干擾技術是一種強大的實驗工具，能夠高效、特異的使靶基因沉默。本實驗擬使用RNA干擾技術實現對Smac基因的特異性沉默，為進一步探索凋亡與白內障形成之間的關系奠定基礎。
　　研究目的：
　　構建針對Smac基因帶有篩

5、選標記的siRNA慢病毒載體并測定目的基因在晶狀體上皮細胞中的表達情況，為利用RNA干擾(RNAi)技術探討白內障發(fā)病機制與細胞凋亡的關系奠定基礎。
　　方法：
　　1.永生化人晶狀體上皮細胞(HLE-B3)的培養(yǎng):將凍存的晶狀體上皮細胞復蘇后，放入含有20％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于含5％CO2、37℃的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，取融合至90％的細胞用于實驗。
　　2.構建針對Smac的慢病毒載體，用于病毒的生產。

6、r>　　3.設立空白對照組、陰性對照組和siRNA組，進行相應病毒感染，病毒感染細胞16h后換液，并在72h后熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白(GreenFluorescentProtein，GFP)在晶狀體上皮細胞的表達。
　　4.慢病毒感染細胞96h后提取細胞中的總RNA，做三次重復的實時定量多聚酶鏈式反應(Real-timePCR)。實驗中我們采用家族管理基因GAPDH作為內參基因。
　　結果：
　　(1)綠色熒

7、光蛋白(GFP)在人晶狀體上皮細胞中成功表達，在熒光顯微鏡下觀察，熒光表達明亮均勻，無明顯細胞毒性，對感染72小時后的細胞照相，發(fā)現每一組的感染率都在80％左右。
　　(2)RT-PCR檢測Smac基因mRNA水平在晶狀體上皮細胞的表達情況發(fā)現siRNA組mRNA的量與陰性對照組比較顯著下調，敲減效率達66.5％。(P＜0.05)。
　　結論：
　　成功構建了慢病毒載體結構來表達siRNA以達到對Smac基因的沉默，為