成年山羊乳腺上皮細胞轉染人乳鐵蛋白基因及細胞株的建立.pdf

1、乳腺生物反應器是當前國內外研究的熱點課題，從理論上講，乳腺上皮細胞轉染乳腺特異性表達融合基因，再進行核移植是可行的，但國內外成功的報道極少。在體細胞核移植和乳腺生物反應器制作成功報道的基礎之上，本課題將乳腺特異性表達載體的構建、奶山羊乳腺上皮細胞(GMFC)系的建立、外源基因轉染奶山羊乳腺上皮細胞及轉染細胞株的建立等幾個方面結合起來，進行轉基因體細胞核移植的相關研究，通過前期細胞水平的整合和表達檢測，挑選陽性細胞株進行克隆羊的制作，旨在

2、降低乳腺生物反應器的制作成本，從而搭建一個可行的制作轉基因動物的平臺，利于進一步的科學研究和實際應用。 1乳腺特異性表達載體的構建 本實驗利用實驗室已有的人乳鐵蛋白cDNA、奶山羊β-乳球蛋白(β-BLG)5`端(4.2Kb)、3`端(1.8Kb)表達調控序列、Neor、增強子序列構建出乳腺特異性表達載體BLC-14。 2奶山羊乳腺上皮細胞系的建立 本實驗用胰蛋白酶組織消化液乳導管注射消化、細胞收集法和乳

3、腺組織塊膠原酶消化兩種方法從泌乳奶山羊的乳腺實質組織中分離得到原代乳腺上皮細胞，DMEM/F12培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)。對兩種方法取的細胞的生長狀況進行比較，結果顯示胰蛋白酶直接消化法獲得的細胞在體外培養(yǎng)至10代左右，細胞開始衰老；膠原酶消化法獲得的細胞在體外培養(yǎng)25代以上仍能保持旺盛的生命力，但上皮細胞中含成纖維樣細胞混合生長，傳代時采用分步胰酶消化反復貼壁法，經(jīng)2～3次的選擇傳代可獲得比較純的乳腺上皮細胞系。 3人乳鐵蛋白基因轉染奶

4、山羊乳腺t-皮細胞及細胞株的建立 通過電轉染法將含有Neor標記基因的BLC-14載體基因片段導入奶山羊乳腺上皮細胞，經(jīng)G418(400μg/ml)篩選培養(yǎng)三周后，得到有抗性的細胞株，挑取單克隆株并進行擴大培養(yǎng)，共73株。經(jīng)PCR檢測，確認31株細胞為轉染了外源基因的細胞株。對轉染有外源基因的細胞株進行誘導表達，分別收集誘導48小時和72小時的誘導液進行ELISA檢測，在誘導48小時和72小時的誘導液中分別有11株細胞的誘導液中