轉(zhuǎn)Temporin-GFP融合基因的山羊乳腺上皮細胞株的篩選.pdf

1、抗菌肽(antimicrobial peptides,ABP)作為一種廣泛存在于生物界僅需20-60個氨基酸組成的小分子活性肽，在抗細菌和真菌以及病原蟲、病毒或腫瘤細胞方面都有明顯的作用。為了建立大量獲取抗菌肽(antimicrobial peptides,ABP)的簡便有效方法，本研究采用分子生物學等方法，構(gòu)建了可以表達抗菌肽Temporin與GFP融合蛋白的乳腺特異性表達載體，并將其轉(zhuǎn)染到奶山羊乳腺上皮細胞中后，通過G418藥物篩選

2、出含有neo抗性基因的轉(zhuǎn)Tem-GFP基因陽性細胞，并篩選獲得基因組中整合有中國林蛙抗菌肽基因的奶山羊乳腺上皮細胞。本研究進一步利用該細胞株通過體細胞核移植的方法獲得乳腺特異表達抗菌肽的轉(zhuǎn)基因山羊的相關研究提供了科學依據(jù)。
　　研究結(jié)果與結(jié)論如下:
　　1、中國林蛙皮膚抗菌肽基因的克隆:根據(jù)GenBank中的中國林蛙皮膚抗菌肽基因mRNA序列(EU624139)設計引物CEa1和2CEa，以提取的中國林蛙皮膚總RNA為模板，

3、進行RT-PCR擴增出中國林蛙皮膚抗菌肽的cDNA。將Temporin的PCR產(chǎn)物與pEASY-T3載體連接，構(gòu)建出T3-Tem-2CEa克隆載體。
　　2、乳腺特異表達載體的構(gòu)建:以T3-Tem-2CEa為模板利用引物CEa3引入Xba1酶切位點，PCR擴增后連入pEASY-T3載體中構(gòu)建T3-Tem-CEa3。再利用酶切、連接等分子克隆手段，將GFP片段插入T3-Tem-CEa3載體后，構(gòu)建T3-Tem-GFP載體。利用Xho

4、Ⅰ與SalⅠ將Tem-GFP片段切下，與XhoⅠ線性化的pBC-1相連接，連接方向鑒定正確后，即成功構(gòu)建出含有抗菌肽以及GFP融合基因的pBC-1乳腺特異表達載體。
　　3、轉(zhuǎn)抗菌肽融合蛋白基因的山羊乳腺上皮細胞的篩選與培養(yǎng):采用陽離子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染線性化的重組乳腺特異性表達載體到奶山羊乳腺上皮細胞中，利用G418篩選獲得具有neo抗性基因的陽性細胞。
　　4、對陽性細胞的鑒定:將獲得的陽性細胞富集后提取細胞基因組，PCR結(jié)果