奶山羊乳腺組織乳脂代謝關(guān)鍵miRNA的篩選及功能驗(yàn)證.pdf

1、羊奶中蛋白質(zhì)、維生素、鈣、礦物質(zhì)、總脂肪含量高，羊奶所含的有益脂肪酸含量（如短、中鏈脂肪酸，不飽和脂肪酸和共軛酸等）均顯著高于牛奶，羊奶中的乳脂代謝非常復(fù)雜，它受多種因素調(diào)控。MiRNA(microRNA)可通過(guò)調(diào)控其靶基因的表達(dá)影響脂肪酸代謝過(guò)程。本研究對(duì)奶山羊不同泌乳時(shí)期（泌乳前期、泌乳盛期、泌乳后期和干奶期）乳腺組織進(jìn)行miRNA篩選后，對(duì)催乳素處理的乳腺上皮細(xì)胞做進(jìn)一步篩選，發(fā)現(xiàn)6個(gè)表達(dá)差異的miRNA。在此基礎(chǔ)上，對(duì)這些篩選出

2、來(lái)的miRNA在功能、調(diào)控關(guān)系以及分子機(jī)制方面進(jìn)行深入研究。得到如下主要研究結(jié)果:
　　1.奶山羊乳腺組織miRNA表達(dá)譜分析及乳脂代謝關(guān)鍵miRNA篩選
　　研究以奶山羊泌乳前期、泌乳盛期、泌乳后期和干奶期的乳腺組織進(jìn)行miRNA表達(dá)量檢測(cè)，基于miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)提供的793條牛的miRNA和267條羊的miRNA進(jìn)行第一輪的篩選，以p值小于0.05且差異在4倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，篩選得到156個(gè)表達(dá)差異的miRNA。隨后使用與

3、發(fā)動(dòng)泌乳密切相關(guān)的因子——催乳素（2.5μg/ml）處理乳腺上皮細(xì)胞，進(jìn)行第二輪篩選。發(fā)現(xiàn)miR-30e-5p，miR-15a，miR-181b，miR-148a，miR-17-5p和miR-135b這6個(gè)miRNA在催乳素處理的乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)差異顯著。
　　2.MiR-181b通過(guò)IRS2(Insulin receptor substrate2)抑制TAG合成并調(diào)控Hippo信號(hào)通路基因
　　在乳腺上皮細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR

4、-181b可以抑制乳脂代謝，而抑制miR-181b可以促進(jìn)乳脂代謝。熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)和Western Blot試驗(yàn)證明了miR-181b的靶基因?yàn)镮RS2。此外，在乳腺上皮細(xì)胞中，miR-181b可以調(diào)控Hippo信號(hào)通路中的多個(gè)作用元件，如LATS1和YAP1。簡(jiǎn)而言之，研究發(fā)現(xiàn)miR-181b通過(guò)調(diào)控Hippo通路上的多個(gè)元件及靶向IRS2抑制脂代謝。
　　3.MiR-30e-5p和miR-15a通過(guò)靶向LRP6和YAP1基因

5、協(xié)同調(diào)控乳脂代謝
　　QRT-PCR和Western Blot試驗(yàn)證明了miR-30e-5p和miR-15a分別通過(guò)靶向Yes相關(guān)蛋白(YAP1)和LDL受體相關(guān)蛋白6(LRP6)來(lái)促進(jìn)脂質(zhì)分化。其中，miR-30e-5p可以調(diào)控β-catenin基因，β-catenin進(jìn)而介導(dǎo)YAP1的表達(dá)。在乳腺上皮細(xì)胞脂代謝中YAP1基因的mRNA和蛋白水平表達(dá)受miR-30e-5p調(diào)控。此外，在乳腺上皮細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-30e-5p和m

6、iR-15a可以促進(jìn)脂代謝，與之相反抑制miR-30e-5p和miR-15a可以減少脂代謝。此外，miR-30e-5p通過(guò)調(diào)控miR-15a表達(dá)水平來(lái)協(xié)同調(diào)控YAP1在乳腺上皮細(xì)胞中的乳脂代謝功能。
　　4.PRL通過(guò)甲基化修飾抑制miR-135b功能
　　QRT-PCR和Western Blot試驗(yàn)證明LATS2作為miR-135b的靶基因來(lái)行使乳脂代謝功能。PRL處理乳腺上皮細(xì)胞時(shí)，對(duì)下調(diào)miR-135b的表達(dá)有一定的時(shí)

7、間和濃度梯度效果。此外，miR-135b的5'端發(fā)現(xiàn)一個(gè)CpG島，通過(guò)調(diào)控CpG島的甲基化來(lái)抑制miR-135b表達(dá)。進(jìn)一步對(duì)PRL處理的乳腺上皮細(xì)胞中miR-135b的功能和作用途徑進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，DNMTI（DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶Ⅰ）表達(dá)水平顯著提高，而miR-135b表達(dá)水平下調(diào)。此外，當(dāng)miR-135b的表達(dá)受到抑制時(shí)，LATS2表達(dá)水平上調(diào)。這就導(dǎo)致乳腺上皮細(xì)胞中乳脂代謝水平提高，從而行使維持泌乳等功能。
　　5.MiR-14

8、8a和miR-17-5p通過(guò)PPAR GC1A和PPARA基因協(xié)同調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞乳脂代謝
　　表達(dá)譜結(jié)果顯示miR-148a、miR-17-5p、PPARGC1A和PPARA在泌乳盛期和干奶期中表達(dá)差異顯著。熒光素酶和Western Blot試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PPARA（脂肪酸調(diào)控重要因子）和PAR GC1A（調(diào)控脂代謝基因）分別是miR-148a和miR-17-5p的靶基因，而miR-148a可以調(diào)控PPARA，miR-17-5p可以

9、調(diào)控PPARGC1A。過(guò)表達(dá)miR-148a和miR-17-5p促進(jìn)甘油三酯(TAG，Triglyceride)的合成，而抑制miR-148a和miR-17-5p降低TAG的產(chǎn)生。重要的發(fā)現(xiàn)是miR-148a和miR-17-5p的協(xié)同作用促進(jìn)了TAG的合成。即在乳腺上皮細(xì)胞中，miR-148a與miR-17-5p分別調(diào)控PPARGC1A和PA RA來(lái)協(xié)同完成TAG的合成，。
　　本研究篩選的6個(gè)miRNA及其靶基因?qū)θ橹x的影響