MiR-26家族對(duì)奶山羊乳腺脂肪酸代謝的調(diào)控作用研究.pdf

1、MiR-26家族屬于內(nèi)含子miRNA，位于羥基末端RNA聚合酶Ⅱ多肽小磷酸酶(CTDSP)家族基因的內(nèi)含子區(qū)。MiR-26a-1定位于3號(hào)染色體，位于CTDSPL基因的第5內(nèi)含子;MiR-26a-2定位于5號(hào)染色體，位于CTDSP2基因的第4內(nèi)含子;MiR-26b定位于2號(hào)染色體，位于CTDSP1基因的第4內(nèi)含子;miR-26a-1和miR-26a-2的成熟體miRNA序列相同。MiR-26可直接作用于LXR的靶基因ABCA1和ARL7

2、，參與細(xì)胞膽固醇外流過程;在脂肪細(xì)胞中，miR-26b的表達(dá)量受到腫瘤壞死因子、瘦素及抑制素的調(diào)控，抑制miR-26b會(huì)阻礙脂肪細(xì)胞的分化，降低脂合成marker基因C/EBPα和PPARG表達(dá)量，下調(diào)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯和脂滴的積累。乳腺作為一種特殊的白色脂肪組織，在泌乳過程中脂肪酸代謝非?；钴S，因此，奶山羊miR-26家族的功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究對(duì)揭示反芻動(dòng)物乳脂形成的機(jī)制具有重要意義，為探討miRNA在乳腺脂肪酸代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要作用奠定

3、基礎(chǔ)。
　　本研究在分析泌乳中期乳腺組織miR-26及宿主基因表達(dá)量與乳成分及乳脂肪酸成分含量相關(guān)性的基礎(chǔ)上，通過miRNA類似物和抑制劑介導(dǎo)的超表達(dá)和干擾技術(shù)探討miR-26a和miR-26b對(duì)乳腺脂肪酸代謝的調(diào)控作用，并同時(shí)干擾miR-26及其宿主基因家族探究其對(duì)脂肪酸代謝的協(xié)同調(diào)控作用;通過對(duì)山羊miR-26家族基因啟動(dòng)子的克隆和突變研究，以及脂代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子對(duì)miR-26家族DNA甲基化水平的影響，系統(tǒng)研究上游調(diào)控因子對(duì)

4、miR-26家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。本研究的主要結(jié)果如下:
　　1.山羊miR-26家族生物信息學(xué)分析及其與乳成分和乳脂肪酸成分的相關(guān)性研究
　　對(duì)miR-26家族同源性分析結(jié)果表明，miR-26家族在山羊、牛、人、小鼠、綿羊中高度保守，且具備相同的種子序列。利用TargetScan和PicTar在線軟件預(yù)測(cè)miR-26家族的靶基因，并利用Kobas在線軟件的GO和KEGG模塊對(duì)靶基因的功能進(jìn)行富集，結(jié)果表明miR-26家族的靶

5、基因參與到Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)、PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、Hippo信號(hào)通路(Hippo signaling pathway)、mTOR信號(hào)通路(mTOR signaling pathway)、脂肪酸合成通路(Fatty acid biosynthesis)等與乳脂代謝重要的信號(hào)通路中。在不同泌乳時(shí)期分析miR-26及其宿主基因（CTDSP）

6、家族表達(dá)量表明，miR-26及CTDSP家族在泌乳期的表達(dá)量顯著高于干奶期，在泌乳盛期表達(dá)量達(dá)到最高峰，且表達(dá)趨勢(shì)一致。在泌乳中期對(duì)miR-26a/b與CTDSP1/2/L表達(dá)量進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)miR-26a與miR-26b呈現(xiàn)出極強(qiáng)的正相關(guān)性，且miR-26a與CTDSP2、miR-26a與CTDSPL、miR-26b與CTDSP1呈現(xiàn)顯著中度相關(guān)。miR-26及CTDSP家族與乳成分及乳脂肪酸成分含量相關(guān)性分析表明，miR

7、-26a/b和CTDSPL與乳中總脂固形物含量顯著中度相關(guān)，而與乳產(chǎn)量、乳糖、乳蛋白及非脂固形物無顯著相關(guān)性;miR-26a與C6∶0、C14∶1、C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1及C18∶3，miR-26b與C6∶0、C14∶1、C16∶1、C18∶0及C18∶3,CTDSP1與C10∶0、C11∶0、C12∶0、C14∶0、C15∶0、及C18∶3，CTDSP2與C14∶1，CTDSPL與C6∶0、C14∶1、C16∶

8、1、C18∶0及C18∶1均呈現(xiàn)中度相關(guān)。
　　2.山羊miR-26家族對(duì)脂肪酸代謝的協(xié)同調(diào)控作用研究
　　在原代山羊乳腺上皮細(xì)胞(GMEC)中單獨(dú)轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-26b mimic后，與對(duì)照組相比miR-26a和miR-26b表達(dá)量顯著上調(diào)，脂肪酸從頭合成（FASN、ACACA）、甘油三酯合成（GPAM、 DGAT1和LPIN1）、脂肪酸去飽和（SCD1和FADS2）、脂肪酸合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（PPARG、SRE

9、BP1和LXRA）和脂滴形成（PLIN2）相關(guān)基因的表達(dá)量顯著上調(diào);細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量和脂滴積累增加;不飽和脂肪酸C16∶1和C18∶2含量顯著增加，飽和脂肪酸C16∶0含量顯著降低;且脂肪酸合成相關(guān)基因PPARG、SREBP1、FASN和SCD1基因DNA甲基化水平下降。與miR-26a處理組相比，miR-26a和miR-26b共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞后脂合成相關(guān)基因FASN、GPAM、 DGAT1、LPIN1、FADS2、SREBF1、PIN2

10、的表達(dá)水平顯著上調(diào)，且細(xì)胞中脂滴積累增加。相對(duì)于miR-26b處理組，miR-26a和miR-26b共同處理組脂合成相關(guān)基因FASN、ACACA、LPIN1、SCD1、FADS2、PPARG、SREBF1表達(dá)量顯著上調(diào)，且不飽和脂肪酸C18∶1含量顯著上調(diào)，飽和脂肪C16∶0含量顯著下調(diào)。靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，胰島素誘導(dǎo)基因1(INSIG1)是miR-26家族影響脂肪酸代謝的一個(gè)潛在靶基因，RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)表明

11、，激活miR-26家族，INSIG1的mRNA和蛋白水平均顯著下調(diào)，且熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-26家族可以直接作用于INSIG1基因3'-UTR。
　　3.山羊miR-26及宿主基因家族對(duì)脂肪酸代謝的調(diào)控作用研究
　　設(shè)計(jì)并合成miR-26家族inhibitor和特異性靶向CTDSP1、CTDSP2和CTDSPL基因的siRNA，轉(zhuǎn)染GMEC后，miR-26和CTDSP家族的表達(dá)量顯著下調(diào)（大于70％）;抑制miR-2

12、6a或miR-26b，脂合成相關(guān)基因FASN、ACACA、GPAM、 LPIN1、DGAT1、SCD1、PLIN2、CD36、PPARG、SREBP1、LXRA表達(dá)量均顯著下調(diào)，靶基因INSIG1表達(dá)量顯著上調(diào)，導(dǎo)致甘油三酯含量和脂滴積累減少，細(xì)胞內(nèi)C16∶0、C18∶0含量顯著增加，而C16∶1和C18∶1含量顯著下降，當(dāng)共同轉(zhuǎn)染miR-26a和miR-26b抑制劑時(shí)，對(duì)以上脂肪酸合成相關(guān)指標(biāo)的影響具有協(xié)同抑制作用。轉(zhuǎn)染CTDSP家族

13、siRNA后，脂合成相關(guān)基因（如SREBP1）顯著下調(diào)，ISNIG1基因顯著上調(diào)，甘油三酯含量、脂滴積累、不飽和脂肪酸C16∶1和C18∶1含量顯著下降，飽和脂肪酸C16∶0含量顯著增加，同時(shí)干擾miR-26a/b及其宿主基因后，對(duì)脂合成相關(guān)基因CD36、FASN、LXRA和SREBP1的表達(dá)量具有協(xié)同抑制作用。
　　4.山羊miR-26a啟動(dòng)子與脂代謝重要轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系研究
　　分別克隆得到miR-26a-1和miR-26

14、a-2基因5'側(cè)翼序列1274 bp和1183 bp，對(duì)啟動(dòng)子序列上轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和CpG島進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)miR-26a-1啟動(dòng)子上分別含有三個(gè)PPRE和SRE位點(diǎn)，含有一個(gè)典型的CpG島;miR-26a-2啟動(dòng)子上含有三個(gè)PPRE、三個(gè)SRE和一個(gè)LXRE位點(diǎn)，含有兩個(gè)典型的CpG島。超表達(dá)SREBP1、PPARG和LXRA可顯著上調(diào)miR-26a和CTDSP2/L表達(dá)水平，下調(diào)miR-26a-1和miR-26a-2啟動(dòng)子

15、DNA甲基化水平。熒光素酶活性試驗(yàn)結(jié)果表明，激活SREBP1、PPARG和LXRA可顯著上調(diào)miR-26a-1和miR-26a-2啟動(dòng)子活性。缺失突變結(jié)果表明，miR-26a-1啟動(dòng)子上PPRE1、SRE1或SRE2位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致啟動(dòng)子活性顯著下降;PPRE1突變后，激活PPARG表達(dá)并不能上調(diào)啟動(dòng)子活性;SRE1或SRE2位點(diǎn)突變，導(dǎo)致SREBP1對(duì)miR-26a-1啟動(dòng)子的激活作用減弱，同時(shí)突變SRE1和SRE2，SREBP1對(duì)其

16、啟動(dòng)子活性無激活作用。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SREBP1蛋白可與miR-26a-1啟動(dòng)子上的SRE1和SRE2位點(diǎn)結(jié)合，直接參與miR-26a-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;SRE1和SRE2同時(shí)突變，LXRA對(duì)啟動(dòng)子活性無影響，表明LXRA通過SREBP1間接調(diào)控miR-26a-1的表達(dá)。利用相同方法證明miR-26a-2啟動(dòng)子上PPRE3、SRE1位點(diǎn)對(duì)其啟動(dòng)子活性的維持具有重要作用。LXRE突變，LXRA對(duì)啟動(dòng)子活性的激活作用減弱，而同時(shí)突變LX

17、RE和SRE1導(dǎo)致LXRA對(duì)miR-26a-2啟動(dòng)子的激活作用消失，表明LXRA通過直接和間接兩種方式參與調(diào)控miR-26a-2的表達(dá)。
　　5.山羊miR-26b啟動(dòng)子與脂代謝重要轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系研究
　　PCR擴(kuò)增得到miR-26b基因5'側(cè)翼序列1102 bp（包含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1018 bp和下游84 bp），對(duì)啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，miR-26b啟動(dòng)子上含有四個(gè)PPRE、四個(gè)SRE位點(diǎn)和兩個(gè)LXRE位點(diǎn)，并含有三個(gè)典

18、型的CpG島。激活SREBP1、PPARG和LXRA可顯著上調(diào)miR-26b和CTDSP1的表達(dá)水平，并下調(diào)miR-26b啟動(dòng)子DNA甲基化水平。啟動(dòng)子熒光素酶活性分析結(jié)果表明，激活SREBP1、PPARG和LXRA可顯著上調(diào)miR-26b啟動(dòng)子活性。定點(diǎn)突變結(jié)果表明，miR-26b啟動(dòng)子上PPRE1、PPRE2、SRE1或SRE3位點(diǎn)的突變可導(dǎo)致啟動(dòng)子活性顯著下降，而LXRE位點(diǎn)的突變對(duì)啟動(dòng)子活性無影響;PPRE1或PPRE2單獨(dú)突變

19、均使下調(diào)PPARG對(duì)miR-26b啟動(dòng)子活性的激活作用，而同時(shí)突變導(dǎo)致PPARG對(duì)miR-26b啟動(dòng)子活性激活作用消失。SRE1或SRE3單獨(dú)突變，導(dǎo)致SREBP1對(duì)miR-26b啟動(dòng)子的激活作用減弱，同時(shí)突變SRE1和SRE3，SREBP1對(duì)其啟動(dòng)子活性無激活作用，ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SREBP1蛋白可與miR-26b啟動(dòng)子上的SRE1和SRE3直接結(jié)合，參與miR-26b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;LXRE突變后，激活LXRA對(duì)miR-26b啟動(dòng)