穩(wěn)定表達分泌型Zika NS1蛋白細胞株的構建及細胞永生化的探索.pdf

1、Zika病毒(Zika virus，ZIKV)感染已成為熱帶和亞熱帶地區(qū)重大的公共衛(wèi)生問題。目前，尚沒有特異性抗ZIKV藥，疫苗也仍處于研發(fā)階段。早期診斷在防止ZIKV傳染中具有重要的意義，在急性感染階段，病毒編碼NS1蛋白并釋放入血。不同黃病毒的NS1蛋白高度保守，因此被用于鑒別診斷，NS1蛋白是用于血清學診斷ZIKV的首選蛋白。
　　永生化細胞PER.C6由Crucell公司通過把人5型腺病毒E1區(qū)編碼基因轉(zhuǎn)染人的18周齡胎兒

2、成視網(wǎng)膜細胞(HER)而獲得。該細胞系具高效、穩(wěn)定表達外源基因能力，在疫苗、重組蛋白、單克隆抗體和基因治療等方面產(chǎn)品的生產(chǎn)得到廣泛應用。然而，昂貴的轉(zhuǎn)讓費用也使得多數(shù)生物制藥公司望而卻步。
　　目的:
　　本研究旨在建立ZIKV NS1蛋白哺乳細胞表達系統(tǒng)，獲得高質(zhì)量NS1抗原，為ZIKV血清學檢測奠定基礎。本研究還初步探索了永生化細胞系的建立方法，以期獲得更具優(yōu)勢的哺乳動物細胞表達工具。
　　方法:
　　將ZI

3、KV NS1表達基因克隆至慢病毒表達載體中，鑒定正確的重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，48h收集慢病毒(LV-CMV-EGFP-Zika-NS1)，將LV-CMV-EGFP-Zika-NS1加入HEK293T細胞中，挑選重組單克隆細胞。分別采用Western Blot和流式細胞分析檢測連續(xù)傳代的重組細胞株上清分泌NS1蛋白水平和細胞熒光率。親和層析純化重組蛋白，SDS-PAGE分析純化效果。將純化的NS1蛋白免疫BALB/c

4、小鼠，間接ELISA測定其血清抗體水平。
　　構建腺病毒E1基因表達載體pUC18-PGK-E1-polyA，轉(zhuǎn)染LO2細胞，48h后對轉(zhuǎn)染的細胞進行1∶100倍稀釋，連續(xù)培養(yǎng)20d，挑選與原始細胞有形態(tài)學差異的細胞灶進行Western Blot鑒定。
　　結(jié)果:
　　酶切和測序結(jié)果表明，成功構建了pLV-CMV-EGFP-Zika-NS1重組表達載體。包裝慢病毒感染HEK293T細胞，采用有限稀釋法獲得8株重組表達Z

5、IKV NS1的單克隆HEK293T細胞株。Western Blot結(jié)果表明其中第7號克隆表達水平最高，將其命名為HEK-293T-Zika-NS1。Western Blot及流式細胞分析結(jié)果表明重組細胞株連續(xù)傳代至第35代其NS1蛋白表達水平、熒光率和熒光強度均未發(fā)生顯著變化。純化的rNS1純度超過90％。純化的rNS1加強免疫BALB/c小鼠后，生成高水平的抗NS1抗體。
　　Western Blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染pUC18-P

6、GK-E1-polyA質(zhì)粒的LO2細胞表達腺病毒E1蛋白，轉(zhuǎn)染的LO2細胞能觀察到與原始細胞有形態(tài)學差異的細胞灶。通過Western Blot鑒定目前尚未篩選到表達Ad5E1蛋白的細胞灶。
　　結(jié)論:
　　本研究成功構建了重組表達ZIKV NS1蛋白的HEK293T細胞系，獲得高純度的重組NS1蛋白。該抗原具有較好免疫原性，刺激小鼠機體產(chǎn)生高水平抗體。該研究為ZIKV血清學診斷方法的奠定基礎，此外建立的重組細胞系為ZIKVN