鵝細(xì)小病毒常州株NS1和VP1基因序列分析及NS1基因的表達(dá).pdf

1、本研究根據(jù)Genbank發(fā)表的GPV B株全基因組序列，設(shè)計(jì)并合成引物，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)擴(kuò)增GPV中國分離株CZ的NSl基因和VPl基因，結(jié)果獲得大小分別約為1.9kb、2.2kb的片段。將該片段分別進(jìn)行克隆及序列測定，并與GPV國內(nèi)外部分已發(fā)表的毒株序列及番鴨細(xì)小病毒的序列比較。結(jié)果表明，我國地方分離株與國內(nèi)外鵝細(xì)小病毒相比，NS1基因和VP1基因均表現(xiàn)出較高的同源性。CZ株與番鴨細(xì)小病毒FM株相應(yīng)序列比較發(fā)現(xiàn)相兩者具有較近的親緣

2、關(guān)系。 將NS1基因片段從pcDNA3.1載體切下，克隆入pGEX-6p-1中，轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞。陽性菌經(jīng)測序正確后，按1:100比例接種2mL LB液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，再以1:100比例接種10mL 2×YT液體培養(yǎng)基，37℃200rpm搖4 h后，加0.5mM IPTG；誘導(dǎo)5 h后，終止培養(yǎng)，進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NS1能夠得到高效可溶性表達(dá)，命名為GST-NS1。對表達(dá)條件進(jìn)一步優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)在不同IPTG

3、工作濃度的誘導(dǎo)下，表達(dá)產(chǎn)物均呈高效可溶性表達(dá)。將表達(dá)產(chǎn)物免疫小鼠獲得的多抗進(jìn)行IFA和Western-blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，GST-NS1具有相應(yīng)的抗原表位。 將NS1基因片段與桿狀病毒轉(zhuǎn)座載體pFastBacl連接，篩選出重組轉(zhuǎn)座載體pFastBacl-NS1，轉(zhuǎn)座含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的大腸桿菌DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞后，獲得重組穿梭質(zhì)粒rBacmid-NS1；將重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲細(xì)胞，獲得了含有GPV CZ株NS1