人類細(xì)小病毒B19基因組NS1、VP1和VP2基因克隆及對(duì)宿主Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響研究.pdf

1、人類細(xì)小病毒B19(Human parvovirusB19)是在1975年被首次發(fā)現(xiàn)的直徑只有23nm的無(wú)包膜單鏈DNA病毒，主要通過(guò)呼吸道、血液、血液制品以及母嬰垂直傳播，呈全球性分布，春季是發(fā)病高峰期。在宿主感染B19病毒后，宿主首先產(chǎn)生IgM，這種免疫球蛋白可以持續(xù)大約3個(gè)月的時(shí)間，感染兩周后，宿主可以產(chǎn)生IgG，這種免疫球蛋白可以在宿主體內(nèi)持續(xù)終生。B19病毒的基因組主要包含三個(gè)開(kāi)放閱讀框:NS1、VP1和VP2。本實(shí)驗(yàn)室前期研

2、究了B19病毒在我國(guó)獻(xiàn)血人群中的流行率，但是關(guān)于B19病毒對(duì)宿主固有免疫，特別是Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的作用還沒(méi)有相關(guān)研究。
　　目的：在Hela細(xì)胞系中高表達(dá)NS1、VP1和VP2,研究高表達(dá)目的基因?qū)τ谒拗魃蓛?nèi)源性干擾素以及對(duì)于宿主Ⅰ型干擾素信號(hào)通路的影響。
　　方法：通過(guò)基因克隆將NS1、ⅥP1和VP2分別克隆到表達(dá)載體pcDNA3.1-3tag上形成pcDNA3.1-3tag-NS1、pcDNA3.1-3tag-VP1

3、和pcDNA3.1-3tag-VP2重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR, RT-PCR)以及免疫印跡(Western Blot，WB)的實(shí)驗(yàn)方法分別檢測(cè)目的基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。在確認(rèn)目的基因可以在蛋白水平高表達(dá)后，我們通過(guò)RT-PCR檢測(cè)目的基因?qū)τ谒拗骷?xì)胞生成內(nèi)源性干擾素以及ISGs表達(dá)的影響;通過(guò)WB檢測(cè)目的基因?qū)TAT1磷酸化的影響;通過(guò)雙熒光報(bào)告基因檢

4、測(cè)目的基因?qū)SRE活性的影響。
　　結(jié)果：成功克隆了NS1、VP1和VP2的重組質(zhì)粒，均能在細(xì)胞mRNA水平高表達(dá)，但只有NS1可以在蛋白水平高表達(dá)。轉(zhuǎn)染NS1后可以促進(jìn)細(xì)胞生成內(nèi)源性干擾素，干擾素刺激后，NS1可以在STAT1磷酸化、ISRE活性以及ISGs表達(dá)三個(gè)層次抑制細(xì)胞Ⅰ型干擾素信號(hào)通路。
　　結(jié)論：NS1可以激活宿主固有免疫，刺激宿主細(xì)胞生成Ⅰ型干擾素，可以在p-STAT1、ISRE活性和ISGs表達(dá)三個(gè)層次抑