新型鴨肝炎病毒全基因組測序及其VP1基因的克隆表達(dá)分析.pdf

1、鴨病毒性肝炎(Duck Virus Hepatitis,DVH)又稱鴨肝炎,是由鴨病毒性肝炎病毒(Duck Hepatitis virus,DHV)引起的一種急性、高度致死性的傳染病,以肝炎為主要特征,主要發(fā)生于三周齡以下雛鴨。目前主要采用傳統(tǒng)的弱毒疫苗和高免卵黃抗體進(jìn)行Ⅰ型DHV的預(yù)防和治療。然而,近幾年來,國內(nèi)許多地區(qū)頻頻出現(xiàn)免疫鴨群爆發(fā)鴨肝炎的報(bào)道,嚴(yán)重制約了養(yǎng)鴨業(yè)的發(fā)展。
　　 1.韓國新型DHV JFX-08株的分離及

2、RT-PCR鑒定
　　 從山東省某疑似鴨肝炎發(fā)病區(qū)分離到1株病毒JFX08；血清中和試驗(yàn)結(jié)果表明該分離毒與傳統(tǒng)的Ⅰ型鴨肝炎病毒無交叉保護(hù)；分離毒回歸3日齡雛鴨,可復(fù)制出鴨肝炎的典型癥狀和病理變化。根據(jù)已公布的韓國新型(基因C型)DHV的序列設(shè)計(jì)合成一對引物,進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,結(jié)果得到大小約414bp的目的條帶；測序分析發(fā)現(xiàn),分離毒與傳統(tǒng)Ⅰ型DHV之間的核苷酸序列相似性較低,而與韓國新型DHV之間的核苷酸序列相似性高達(dá)93.2

3、％～94.0％；進(jìn)化分析結(jié)果表明,該分離毒與韓國新型DHV的遺傳距離最近,屬基因C型DHV。
　　 2.新型DHV JFX-08分離株全基因組序列測序與分析
　　 根據(jù)已發(fā)表的DHV基因組序列設(shè)計(jì)多對特異的引物,按常規(guī)RT-PCR方法擴(kuò)增毒株的中間相應(yīng)區(qū)域,采用5’和3’cDNA末端快速擴(kuò)增(Rapidamplification of cDNA ends,RACE)方法擴(kuò)增病毒RNA的5’和3’末端序列。對分離株JFX0

4、8的全基因組進(jìn)行了序列測定分析。結(jié)果表明,JFX08的基因組全長為7793nt,包括652nt的5’UTR、6753nt的ORF、366nt的3’UTR以及19nt的poly(A)尾巴。JFX08的ORF編碼2251個(gè)氨基酸,各基因均與韓國新型的氨基酸序列相似性最高,與Ⅰ型DHV和臺灣新型DHV的相似性均較低。其中VP1較Ⅰ型DHV存在2個(gè)氨基酸的插入和較多氨基酸位點(diǎn)的突變,高變區(qū)主要集中在180-194位和213-219位。JFX08

5、的非編碼區(qū)核苷酸序列之間存在大量堿基突變和插入/缺失。
　　 3.新型DHV VP1基因的克隆表達(dá)及其多克隆抗體的制備
　　 采用RT-PCR方法,擴(kuò)增基因C型DHV JFX08株的VP1基因,與pMD18-T載體進(jìn)行連接,構(gòu)建新型DHV VP1基因克隆重組質(zhì)粒。然后將VP1基因定向插入到pET-32a(+)表達(dá)載體中,篩選原核表達(dá)載體pET-32a-VP1,進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE電泳分析表明,基因C型D