山羊痘病毒基因組提取、酶切及TK基因克隆測序分析.pdf

1、羊痘（山羊痘和綿羊痘）是由羊痘病毒屬（Capripoxvirus）病毒引起的山羊及綿羊的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。本病在印度、孟加拉、中東以及非洲中北部地區(qū)呈地方性流行，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重的危害和巨大經(jīng)濟(jì)損失。被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類傳染病，在我國被列為一類傳染病。本試驗(yàn)對(duì)山羊痘病毒熒光PCR檢測方法的建立、體外增殖規(guī)律、基因組酶切圖譜差異及TK基因進(jìn)行了相關(guān)研究。
　　1.山羊痘病毒 SYBR Green I熒

2、光 PCR檢測方法的建立為建立山羊痘病毒（goat pox virus，GPV）的SYBR Green I模式熒光 PCR方法，根據(jù)山羊痘病毒的反向末端重復(fù)序列（Inverted Terminal Repeat，ITR）的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物。以此引物和山羊痘皮膚痘疹提取的DNA為模板，建立并優(yōu)化 SYBR Green I模式熒光 PCR檢測山羊痘病毒的ITR基因的方法，并與普通 PCR方法進(jìn)行敏感性比較。結(jié)果表明：所建立的檢測山羊痘病毒

3、的SYBR Green I模式熒光 PCR方法能檢測出7×102拷貝數(shù)的DNA模板，比文獻(xiàn)報(bào)道的普通 PCR法更敏感、準(zhǔn)確、快速。
　　2.山羊痘病毒體外增殖規(guī)律初探將山羊痘病毒標(biāo)準(zhǔn)弱毒株（B）和分離毒株（LD）接種Vero細(xì)胞，感染細(xì)胞后每隔12 h觀察細(xì)胞病變并收獲細(xì)胞培養(yǎng)物，用已建立的SYBR Green I模式熒光 PCR檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中山羊痘病毒含量并繪制生長曲線，可見：在Vero細(xì)胞中，二個(gè)毒株的增殖規(guī)律基本相似，山羊

4、痘病毒各毒株在感染12 h時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒含量就開始增加，在72 h～96 h時(shí) CPE最為明顯，Vero細(xì)胞中的病毒含量也達(dá)到最高。從而進(jìn)一步了解了山羊痘病毒的增殖規(guī)律，山羊痘病毒在Vero細(xì)胞中的增殖高峰期為72 h～96 h，也是病毒收獲的最佳時(shí)期，為疫苗的生產(chǎn)及后續(xù)試驗(yàn)提供了科學(xué)依據(jù)。
　　3.山羊痘病毒基因組DNA的提取及酶切分析山羊痘病毒貴州分離株（LD株和QL株）和參考株（Y株和B株），采用Vero細(xì)胞增殖和差速

5、離心濃縮后，以SDS-蛋白酶 K法提取病毒基因組DNA，以三種核酸內(nèi)切酶 EcoR I、HindⅢ和Pst I進(jìn)行酶切，并進(jìn)行酶切圖譜分析，得出結(jié)果：病毒基因組提取樣本的純度在1.8～1.9之間，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳均出現(xiàn)一條純凈的DNA條帶；經(jīng)3種內(nèi)切酶酶切后，貴州分離株的酶切圖譜與參考疫苗毒株 Y株基本一致，而比參考弱毒株 B株少3～4條酶切片段。為山羊痘病毒毒力基因的進(jìn)一步研究提供了基礎(chǔ)。
　　4.山羊痘病毒TK基因的克隆與序列