山羊痘病毒“GTPV_gp024”基因區(qū)插入外源基因的表達(dá)研究.pdf

1、山羊痘病毒活載體疫苗是目前山羊痘病毒(GTPV)新型疫苗的研究方向?；谏窖蚨徊《净蚪M龐大，復(fù)制非必需區(qū)多，且具有感染特異性，可以在山羊痘病毒上插入多種免疫原基因，成為活載體疫苗的首選病毒載體。當(dāng)前對(duì)插入位點(diǎn)的研究主要集中在山羊痘病毒TK基因上，選擇多個(gè)合適的外源片段插入?yún)^(qū)成為構(gòu)建山羊痘病毒載體所需解決的首要問(wèn)題。 本研究首先以山羊痘病毒弱毒疫苗株AV41為親本毒，克隆軟脂酰化EEV囊膜蛋白( GTPV_gp024)部分，通過(guò)

2、測(cè)序和序列分析顯示，GTPV_gp024全長(zhǎng)1113bp，編碼371個(gè)氨基酸，核苷酸序列與GTPV pellor株病毒相應(yīng)序列比較，同源性達(dá)到99.8％，與其它痘病毒相關(guān)基因的氨基酸同源性達(dá)到50％以上。該片段與正痘病毒的F13L基因的p37蛋白功能相似，該基因缺失不影響病毒的復(fù)制和傳播，可以作為外源基因的插入?yún)^(qū)。 缺失GTPV_gp024部分基因，設(shè)計(jì)同源臂引物，插入LacZ痘病毒背靠背啟動(dòng)子P11-P7.5和GPT表達(dá)盒，構(gòu)

3、建轉(zhuǎn)移載體。轉(zhuǎn)移載體與親本毒共轉(zhuǎn)染羊睪丸(LT)細(xì)胞，重組病毒反復(fù)篩選三代用X-gal染色均有藍(lán)斑出現(xiàn)，初步表明GTPV_gp024可以作為外源基因插入?yún)^(qū)。 通過(guò)調(diào)整同源臂長(zhǎng)度，更換報(bào)告基因的手段，構(gòu)建含有EGFP-GPT的轉(zhuǎn)移載體，共轉(zhuǎn)染LT細(xì)胞，經(jīng)過(guò)黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶加壓篩選，第五代以后重組病毒經(jīng)熒光觀察和PCR擴(kuò)增鑒定為陽(yáng)性，且無(wú)親本毒的污染，毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組病毒的滴度略有下降。 綜上所述，GTPV軟