羊傳染性膿皰病毒B2L基因重組山羊痘病毒的構(gòu)建及初步評(píng)價(jià).pdf

1、羊傳染性膿皰病是由羊傳染性膿皰病毒引起的綿羊、山羊等反芻動(dòng)物以及人類的一種急性、高度嗜上皮性、接觸性傳染病。該病在世界養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)廣泛流行,危害較大,造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失,目前尚無有效的治療藥物;接種疫苗被認(rèn)為是控制該病可靠而有效的手段。當(dāng)前常規(guī)弱毒苗和滅活苗存在毒力返強(qiáng)、不安全、免疫保護(hù)率不高等缺點(diǎn),急需開發(fā)一種新型的候選疫苗株以便更好的預(yù)防該病的發(fā)生和流行。羊痘病毒作為載體表達(dá)外源基因的有效性已經(jīng)被大量研究所證實(shí)。因此,本研

2、究選取商品化的山羊痘弱毒疫苗作為載體,構(gòu)建表達(dá)羊傳染性膿皰病毒B2L基因的重組山羊痘病毒,并對(duì)其遺傳穩(wěn)定性、理化特性和免疫原性進(jìn)行檢測和初步評(píng)價(jià),旨在獲得能同時(shí)預(yù)防山羊痘和羊傳染性膿皰病的雙價(jià)基因工程疫苗。為此,本研究主要開展以下研究工作:
　　1.分離鑒定羊傳染性膿皰病毒。對(duì)新疆地區(qū)疑似羊傳染性膿皰病的羔羊唇部結(jié)痂進(jìn)行采集,研磨過濾后接種Vero細(xì)胞,分離培養(yǎng)病毒,待出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變時(shí),收集細(xì)胞進(jìn)行電鏡觀察;通過PCR技術(shù)擴(kuò)增羊

3、傳染性膿皰病毒B2L基因,進(jìn)行測序分析。同時(shí)對(duì)該分離株和Genbank上公布的中國其他省市區(qū)的30個(gè)分離株的B2L基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:羊傳染性膿皰病毒接種細(xì)胞后出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變,通過電鏡觀察到200nm左右的病毒粒子;PCR技術(shù)檢測出了大小為1137bp的特異性目的片段。該分離株與其他分離株的核苷酸序列同源性為96.0％-99.1%,氨基酸的同源性為88.7%-99.2%;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示該分離

4、株與NX/YC-2010分離株遺傳距離最近。
　　2.構(gòu)建羊傳染性膿皰病毒B2L基因重組山羊痘病毒并研究其生物學(xué)特性。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建含有良好免疫原性的ORFV011(B2L)基因的重組山羊痘病毒。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增B2L基因,通過分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體,并利用脂質(zhì)體法將其轉(zhuǎn)染已接種山羊痘弱毒株病毒的BHK-21細(xì)胞,進(jìn)行同源重組。利用X-gal藍(lán)白斑篩選重組山羊痘病毒rGPV-B2L。應(yīng)用PCR、間接免疫熒光和Wes

5、tern免疫印跡等方法對(duì)重組病毒進(jìn)行檢測與鑒定。通過TCID50對(duì)該重組病毒的理化特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:本研究成功構(gòu)建了重組病毒轉(zhuǎn)移載體。通過藍(lán)白斑篩選純化獲得了重組山羊痘病毒rGPV-B2L,并且連續(xù)傳代20次后重組病毒B2L基因能夠在BHK細(xì)胞中穩(wěn)定的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。理化特性檢測顯示該重組病毒經(jīng)55℃30min或紫外照射60min即可被滅活,且對(duì)強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑等較敏感。
　　3.初步評(píng)價(jià)重組山羊痘病毒的毒力及免疫

6、效果。為了評(píng)價(jià)該重組病毒作為候選疫苗的免疫效果,本文采用初免-加強(qiáng)免疫的策略對(duì)6-8周齡的雌性小鼠進(jìn)行皮下注射,通過間接ELISA檢測小鼠血清中的特異性抗體水平,通過雙夾心ELISA評(píng)估其細(xì)胞免疫和體液免疫水平,同時(shí)通過攻毒實(shí)驗(yàn)對(duì)該重組病毒的免疫保護(hù)力進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示:重組病毒候選疫苗首免后1周,血清中即可檢測到B2L特異性抗體;加強(qiáng)免疫后,血清中的抗體水平顯著升高,表明該重組病毒可激發(fā)較高的體液免疫。對(duì)IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因

7、子的檢測結(jié)果顯示,該重組病毒也可強(qiáng)烈地激活機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答。因此,本研究證實(shí)該重組病毒候選疫苗能夠刺激小鼠產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。此外,我們通過攻毒實(shí)驗(yàn)對(duì)重組病毒的保護(hù)力進(jìn)行評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn),本研究構(gòu)建的重組病毒候選疫苗能夠提供有效地免疫保護(hù)作用。該研究結(jié)果為今后進(jìn)行本體動(dòng)物的免疫試驗(yàn)及臨床的初步應(yīng)用提供理論依據(jù),同時(shí)也為ORFV免疫特性的闡明奠定基礎(chǔ)。
　　本研究結(jié)果表明我們成功分離到羊傳染性膿皰病毒,并且獲得了可穩(wěn)定表