山羊痘病毒基因缺失重組毒株的構建與生物學特性鑒定.pdf

1、山羊痘是一種急熱性傳染病，由山羊痘病毒(goatpoxvirus，GTPV)引發(fā)，臨床上以出現(xiàn)發(fā)熱和全身起痘為典型特征，具有很高的發(fā)病率和死亡率。我國目前使用山羊痘弱毒疫苗AV41株來預防山羊痘，但其在我國部分省份尤其是南方部分地區(qū)的羊痘防疫過程中，發(fā)現(xiàn)存在有安全隱患，可產(chǎn)生諸多不良反應，如全身發(fā)痘、孕羊流產(chǎn)等。因此，有必要進一步研制更為安全有效的新型基因工程疫苗。
　　 本研究利用分子生物學、病毒學和免疫學等方面的技術和手段，

2、以GTPV弱毒疫苗毒株AV41為模板，分別設計4對引物，PCR擴增ORF5～ORF19和ORF149～ORF15兩個區(qū)域兩側共四個基因組片段，分別作為同源重組左側臂和右側臂；運用分子技術，分別將兩側重組臂相連，并在兩個重組臂中間插入報告基因EGFP和篩選基因gpt的表達盒，構建轉移載體質(zhì)粒pLF-Eg和pRF-Eg;分別將轉移載體質(zhì)粒pLF-Eg和pRF-Eg與GTPVAV41株共轉染非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)，使其在細胞內(nèi)發(fā)生同源

3、重組，加壓篩選并純化重組GTPV;最后鑒定重組GTPV和檢測其生物學特性。
　　 通過一系列實驗研究，確定了GTPV基因組中的兩個病毒復制非必需區(qū)，分別成功構建了敲除掉GTPV毒力相關基因ORF5～ORF19之間共15個ORF和ORF149～ORF151之間共3個ORF的兩株重組山羊痘弱毒株。同時證實這兩個基因重組缺失毒株均可穩(wěn)定遺傳，并保持了親本毒株在細胞培養(yǎng)物中的生長特性。這為研制更安全、高效的山羊痘基因工程弱毒疫苗奠定基礎