兩株缺失SORF3-TK基因重組鴨腸炎病毒的構建及其基本生物學特性研究.pdf

1、鴨病毒性腸炎(duck viral enteritis，DVE)，又名鴨瘟(duck plague，DP)，是鴨、鵝及多種雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病，曾相繼在多個國家和地區(qū)流行，給養(yǎng)鴨業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。本病病原為鴨腸炎病毒(Duck enteritis virus，DEV)，亦稱鴨皰疹病毒1型(Anatid herpesvirus1),在2011年第九次病毒分類報告(ICTV)中，將其劃分為皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科馬

2、立克病毒屬。
　　 根據(jù)本實驗室克隆DEV C-KCE株US區(qū)序列和TK序列設計引物，擴增同源臂基因，將左右同源臂基因克隆至pEASY-blunt simple和pMD18-T simple載體，構建pEASY-S3和pMD18T-TK載體。將表達盒插入pEASY-S3、pMD18-T-TK兩同源臂構建缺失病毒轉移載體pEASY-S3-gpt-EGFP、pMD18-T-TK-gpt。將重組載體與DEV感染細胞的總DNA共轉染次代

3、鴨胚成纖維細胞(DEF)，利用霉酚酸(MPA)加壓，8代篩選、富集和純化，得到重組病毒，經(jīng)PCR、IIF鑒定正確，命名為DEV-AS3、DEV-ATK。
　　 分別提取雞胚成纖維(CEF)細胞和DEF細胞上不同代重組病毒DEV-△S3、DEV-△TK基因組分別擴增鑒定基因皆得到陽性結果，證明缺失重組病毒穩(wěn)定存在。將100 TCID50 DEV和DEV-△S3以及DEV-△TK分別接種于CEF細胞，在不同時間分別收集接毒后細胞上清

4、、接毒后細胞和上清以及接毒后用胰酶消化的細胞，測定病毒效價，繪制病毒生長曲線，結果表明SORF3基因和TK基因可能與DEV病毒的侵入有關。親本病毒與重組病毒的蝕斑大小無顯著差異，表明SORF3和TK基因的缺失并沒有影響病毒的毒力。
　　 測定親本病毒與重組病毒效價，以5000 TCID50/只將重組病毒及親本病毒免疫4周齡SPF鴨，每組隔離培養(yǎng)，設立同居組、親本病毒組及疫苗組對照。每周采集鴨血收集血清，利用間接ELISA方法檢測

5、血清中抗體IgG的變化規(guī)律。結果顯示，重組病毒和親本病毒免疫組比疫苗免疫組產(chǎn)生抗體的時間稍晚，但抗體持續(xù)時間比疫苗免疫組要長，重組病毒免疫組的抗體水平略低于親本病毒免疫，差異不顯著，同居組的抗體水平略有上升仍為陰性;同時也對各組免疫鴨的咽及泄殖腔棉拭子進行了DEV的基因檢測，沒有擴出相應的目的片段，說明重組病毒和親本病毒免疫并不能引起免疫鴨的排毒。中和抗體試驗的結果顯示重組病毒組與親本病毒具有相似的免疫原性。免疫后第九周分別取親本病毒組