山羊痘病毒P32基因克隆、測序及表達.pdf

1、目的：山羊痘是由羊痘病毒屬山羊痘病毒（GPV）引起的一種高度接觸性傳染病，呈地方性流行，對養(yǎng)羊業(yè)造成嚴重的危害和巨大經(jīng)濟損失。為了解山羊痘病毒貴州分離毒株與國內(nèi)外毒株的序列關(guān)系和P32蛋白的抗原性，本研究開展了GPV P32基因的克隆、測序、序列分析、體外表達及表達蛋白的抗原性研究，期望獲得利用該基因建立山羊痘基因工程疫苗及診斷方法的理論依據(jù)。
　　方法：應(yīng)用PCR方法擴增山羊痘病毒貴州分離株 QL株、LD株和參考毒株 Y株、B株

2、 P32基因，克隆至 pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pMD18-T-P32，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到 DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng) PCR和酶切初步鑒定為陽性的重組菌進行序列測定，并將所得序列與GenBank收錄的國內(nèi) GPV的P32基因進行序列分析；選擇貴州代表毒株 LD株 P32基因的推導(dǎo)氨基酸序列為材料，應(yīng)用計算機技術(shù)和生物學(xué)軟件預(yù)測P32蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)、柔韌性、表面可及性和二級結(jié)構(gòu)，并綜合評價 P32蛋白可能存在的B細胞

3、抗原表位；以含山羊痘病毒貴州 LD株 P32基因的質(zhì)粒 pMD18-T-P32/LD為模板，應(yīng)用PCR方法擴增 P32基因，將基因片段克隆至原核表達載體 pET-28a和畢赤酵母菌表達載體 pPICZαA，構(gòu)建重組表達載體，分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 BL21(DE3)中并誘導(dǎo)其表達，應(yīng)用SDS-PAGE和Western-Blotting試驗分析蛋白表達情況；通過 Ni柱親和層析和G-100層析技術(shù)對表達蛋白產(chǎn)物進行純化，分別應(yīng)用瓊脂雙擴散試驗

4、和免疫動物實驗檢測純化蛋白的抗原性。
　　結(jié)果：將 GPV-QL、GPV-LD、GPV-Y和GPV-B毒株的P32基因序列分析顯示，GPV貴州分離株之間核苷酸同源性高達99.9％，與國內(nèi)其它 GPV分離株的核苷酸同源性達到99.7％～100％，與國外 GPV分離株核苷酸同源性達到99.5％～99.6％，表明P32基因高度保守；P32蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)、親水性、抗原指數(shù)、柔韌性、表面可及性和二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，P32蛋白含有一個跨膜結(jié)

5、構(gòu)，肽段227-251區(qū)域的各種預(yù)測指數(shù)均高，推斷該區(qū)域存在一個潛在的優(yōu)勢抗原表位。
　　以pMD18-T-P32/LD質(zhì)粒為模板，擴增 P32基因并克隆至表達載體，構(gòu)建原核重組表達載體和真核重組表達載體，轉(zhuǎn)化至相應(yīng)的宿主菌中進行誘導(dǎo)表達。結(jié)果表明，P32基因能通過原核表達載體 pET-28a和畢赤酵母真核表達載體 pPICZαA在各自宿主菌 BL21(DE3)、X-33中獲得表達，SDS-PAGE和Western-Blottin

6、g分析顯示表達蛋白分子量分別為35.5KD和64KD；表達蛋白通過 Ni柱親和層析和Sephadex G-100層析獲得純化，該純化蛋白在瓊脂擴散試驗中與山羊痘陽性血清出現(xiàn)特異性的沉淀線，而與陰性血清不發(fā)生反應(yīng)；采用純化蛋白接種家兔制備免疫血清，該免疫血清使山羊痘病毒感染力減少50％的中和指數(shù)達到1:123.07。
　　結(jié)論：通過對山羊痘病毒株 P32基因的克隆測序及序列分析表明，P32基因序列同源性高度保守，P32蛋白含有一個跨