山羊痘病毒P32基因跨膜區(qū)缺失載體的構(gòu)建與表達(dá).pdf

1、本課題首先建立了羊痘與羊口瘡二重PCR診斷方法，試驗(yàn)表明該方法特異性強(qiáng)、敏感性高，可檢測(cè)到4pg的DNA模板，能很好區(qū)分癥狀相似的山羊痘和羊口瘡，本試驗(yàn)檢測(cè)了7份疑似山羊痘病料，檢出山羊痘陽(yáng)性6份，羊口瘡陽(yáng)性1份。對(duì)廣西山羊痘6份陽(yáng)性病料和國(guó)內(nèi)現(xiàn)用的山羊痘疫苗株的p32蛋白的全基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，并將序列上傳至Genbank中(序列號(hào)分別是EF522176、EF522177、EF522178、EF522179、EF5221

2、80、EF522181)．序列分析結(jié)果表明，廣西分離株之間的核苷酸同源性99.4-100％，推導(dǎo)的氨基酸同源性為98.1-99.7％，山羊痘廣西分離株與哈薩克斯坦AY077835、 NC004003以及印度的AY382369、AY159333和中國(guó)哈爾濱的AY881707分離株的核苷酸同源性為99.6-99.9％，推導(dǎo)的氨基酸同源性為98.8-99.7％；與國(guó)內(nèi)使用的疫苗株的核苷酸同源性為99.3-99.8％，推導(dǎo)的氨基酸同源性為97.

3、8-99.4％；廣西分離株、哈薩克斯坦的AY077835、NC004003，印度的 AY382369、AY159333和中國(guó)哈爾濱的AY881707與現(xiàn)用的疫苗株相比，在34-35位都缺失了2個(gè)氨基酸；廣西分離株核苷酸6151位的堿基全部由T變?yōu)镃，647-652位核苷酸構(gòu)成由TGTATA變異為TGTACA，多了1個(gè)限制性內(nèi)切酶Bsp1407I位點(diǎn)，而疫苗株和國(guó)內(nèi)及國(guó)外的AY077835、NC004003、AY382369、 AY159

4、333、AY881707在647-652位核苷酸都沒(méi)有該限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，因此用限制性內(nèi)切酶Bsp1407I可以區(qū)分疫苗株與廣西分離株，本文建立了PCR-RFLP方法，疫苗株可以切成135bp和604bp兩個(gè)片段，廣西分離株可以切成135bp、226bp和378bp三個(gè)片段。為了進(jìn)一步研究P32基因，本研究利用重組PCR技術(shù)消除P32基因跨膜區(qū)，用DNAstar軟件對(duì)跨膜區(qū)缺失前后的蛋白圖譜分析可知，跨膜區(qū)缺失前后的蛋白跨膜區(qū)位置的

5、折疊構(gòu)象、螺旋發(fā)生了一定變化，但抗原性在缺失前后未見(jiàn)變化，因此構(gòu)建了一個(gè)缺失片段的重組質(zhì)粒pGEX-S6，把該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)，用IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果顯示檢測(cè)到P32基因的表達(dá)產(chǎn)物，用BandScan軟件對(duì)表達(dá)產(chǎn)物分析，優(yōu)化反應(yīng)條件，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為5h，IPTG最佳誘導(dǎo)濃度是0.8mmol/I，最佳誘導(dǎo)溫度是37℃，優(yōu)化后表達(dá)的蛋白占菌體蛋白的29.4％，表達(dá)產(chǎn)物以融合蛋