蘋果莖痘病毒cp基因介導(dǎo)病毒抗性研究及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、蘋果莖痘病毒（Apple stem pitting virus ASPV）是蘋果和梨樹上普遍發(fā)生的潛隱病毒之一，該病毒與其它病毒的復(fù)合侵染可導(dǎo)致這些果樹的衰退。利用基因工程技術(shù)導(dǎo)入病毒外殼蛋白（cp）基因，培育抗病毒品種，為病毒病的防治開辟了新的途徑。
　　 本研究通過PCR擴(kuò)增和Western blot分析，對(duì)轉(zhuǎn)化ASPV的cp基因的14個(gè)西方煙（Nicotiana occidentalis）芽系中外源基因的插入及表達(dá)進(jìn)行了檢

2、測；采用汁液摩擦接種方法，進(jìn)行了轉(zhuǎn)化植株的病毒抗性測定；構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMBIA1301S-cp（+）-gfp和pCAMBIA1301S-cp（-）-gfp，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法成功轉(zhuǎn)染西方煙。具體研究結(jié)果如下：
　　 1、以實(shí)驗(yàn)室保存的轉(zhuǎn)ASPV cp基因正義鏈和反義鏈的14個(gè)轉(zhuǎn)基因西方煙芽系為材料，提取基因組DNA，用三對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析，得到三個(gè)不同的特異性條帶，分別為316

3、bp（CP基因的其中一段）、565bp（潮霉素基因）、1203bp（CP基因全長），確認(rèn)有13個(gè)芽系經(jīng)6次繼代篩選后外源基因得到穩(wěn)定遺傳。
　　 2、取PCR鑒定含有ASPV cp的轉(zhuǎn)基因煙草植株S1提取總蛋白，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因煙草植株為對(duì)照，進(jìn)行SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮藍(lán)染色結(jié)果表明，含ASPV cp的轉(zhuǎn)基因植株有分子量約44 kDa的特異性蛋白條帶，而未轉(zhuǎn)基因植株則沒有相應(yīng)的蛋白條帶產(chǎn)生。以ASPV多克隆抗體為一抗，堿性

4、磷酸酯酶標(biāo)記羊抗兔抗體為二抗，對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中外源基因的表達(dá)進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果顯示，44 kDa大小的特異性表達(dá)產(chǎn)物與ASPV多克隆抗體產(chǎn)生明顯的免疫反應(yīng)，表明所轉(zhuǎn)化的ASPV CP基因正義鏈在轉(zhuǎn)基因煙草植株中能正常表達(dá)。
　　 3、對(duì)部分T0代轉(zhuǎn)基因煙草離體植株進(jìn)行生根移栽，在幼苗長至4-6葉齡時(shí)接種ASPV進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，同時(shí)以未轉(zhuǎn)基因植株作為對(duì)照。接種15d后觀察癥狀，所有的未轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出典型的白色壞死

5、斑； 8個(gè)芽系S1、S5、S6、S7、S8、S10、A1、A3中的24株都無癥狀發(fā)生，表現(xiàn)出對(duì)該病毒的抗性。6個(gè)芽系S2、S3、S4、S9、A2、A4中的18株均出現(xiàn)典型癥狀，表現(xiàn)為感病。
　　 4、采用PCR擴(kuò)增和酶切的方法，回收純化gfp和ASPV的cp基因，分別構(gòu)建了ASPV的cp基因正義鏈和反義鏈與gfp基因融合的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301S-cp（+）-gfp和pCAMBIA1301S-cp（-）-gfp。將重