鵝細(xì)小病毒NS1基因植物真核表達(dá)載體的構(gòu)建及向苜蓿中的轉(zhuǎn)化.pdf

1、小鵝瘟(Goose plague，GP)是由鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus，GPV)引起的一種主要侵害4～10日齡雛鵝的急性或亞急性敗血性傳染病，是危害養(yǎng)鵝業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。GPV屬細(xì)小病毒科(Parvoviridae)、細(xì)小病毒屬(Parvovirus)成員。含有兩個(gè)開(kāi)放閱讀框，左側(cè)閱讀框編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2，右側(cè)閱讀框編碼結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2及VP3。其中NS1在病毒毒性、病毒復(fù)制及調(diào)節(jié)基因的表達(dá)方面發(fā)揮

2、了重要的作用。試驗(yàn)通過(guò)對(duì)鵝細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因轉(zhuǎn)化苜蓿的探索，研究植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)在表達(dá)鵝細(xì)小病毒抗原中的應(yīng)用，為進(jìn)一步研究鵝細(xì)小病毒NS1蛋白的生物學(xué)特性、揭示鵝細(xì)小病毒致病機(jī)理及研制口服疫苗提供科學(xué)依據(jù)。 根據(jù)Genebank上發(fā)表的GPVB株基因組核苷酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，PCR擴(kuò)增出鵝細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1全長(zhǎng)基因，約2022bp，將其克隆到含有CaMV35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體pBI121中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌J

3、M109感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-NS1，利用改進(jìn)的熱激法將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌LBA4404，構(gòu)建NS1植物雙元表達(dá)載體，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化苜蓿的載體系統(tǒng)。 選用紫花苜蓿“金皇后”2～5天的子葉、下胚軸和15天左右的幼嫩葉片為材料，誘導(dǎo)篩選出良好的胚性愈傷組織，以該愈傷組織為受體，通過(guò)葉盤轉(zhuǎn)化法將GPV的NS1基因轉(zhuǎn)化苜蓿，卡那霉素抗性篩選后，獲得抗性植株52株。提取抗性植株葉片基因組DNA做PCR特異性擴(kuò)增，擴(kuò)