豬細(xì)小病毒（PPV-SC1）的分離、鑒定及其非結(jié)構(gòu)蛋白NS1基因的克隆和序列分析.pdf

1、豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus,PPV)為引起母豬繁殖障礙的主要病原之一,豬細(xì)小病毒感染的主要特征是孕豬在懷孕前容易受到感染,可引起胚胎或胎兒的感染和死亡,導(dǎo)致母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、胎兒木乃伊化及新生仔豬的死亡.PPV感染普遍存在于世界各地的豬群中,目前中國PPV的感染呈上升趨勢(shì).診斷、預(yù)防和控制PPV的流行對(duì)于中國的養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展具有重要的意義.該文從流產(chǎn)的死胎及木乃伊胎中分離出了一株病毒PPV-SC1,該株病毒能在豬腎

2、原代細(xì)胞、PK-15細(xì)胞、ST細(xì)胞和IBRS-2細(xì)胞上增殖并引起細(xì)胞病變,出現(xiàn)細(xì)胞的聚集、融合現(xiàn)象;分離毒能凝集0.5﹪的豚鼠紅細(xì)胞,血凝效價(jià)可達(dá)1:2<'11>,血凝抑制效價(jià)可達(dá)1:2<'10>;熒光抗體染色在細(xì)胞核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)中均可見到特異性熒光,呈蘋果綠色;電鏡正染觀察病毒粒子為無囊膜、球形、大小約23nm的病毒粒子.根據(jù)GenBank中PPV NADL-2株病毒基因組序列用Oligo6.0設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,以抽提的PPV-SC1 R

3、F-DNA為模板,通過PCR擴(kuò)增出長約2.2kb的DNA片段,將其插入克隆載體質(zhì)粒pMD 18-T的E0coRV酶切位點(diǎn)處,構(gòu)建重組質(zhì)粒pTNS1,對(duì)重組質(zhì)粒pTNS1進(jìn)行序列測(cè)定,測(cè)序結(jié)果顯示PPV-SC1 NS1基因全長1989bp,包含完整的PPV-SC1 NS1基因的開放閱讀框架,共編碼662個(gè)氨基酸.將PPV-SC1 NS1序列與其他PPVNS1基因進(jìn)行多序列比對(duì),結(jié)果顯示,PPV-SC1 NS1與其他的PPV NS1的同源性

4、較高,僅存在個(gè)別的差異,分別是第39位A→G,第153位T→C,第175位A→G,第1117位A→C,第1535位A→C;同源搜索比較表明,PPV-SC1與PPV NS1同源性可達(dá)98﹪、99﹪,與其他的細(xì)小病毒NS1基因也存在很大的保守性;密碼子偏向性分析結(jié)果表明PPV-SC1 NS1基因在同一氨基酸的不同密碼子的選擇上存在一定的偏向性;PPV-SC1 NS1蛋白總體上說具有親水性不存在明顯的疏水性區(qū)段,用swiss TMPRED軟件

5、預(yù)測(cè)PPV-SC1 NS1的跨膜區(qū),返回的結(jié)果并沒有得到有顯著意義的跨膜區(qū)的存在;根據(jù)基于motif數(shù)據(jù)庫的結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),PPV-SC1 NS1的第393-415位氨基酸殘基存在潛在的ATP/GTP結(jié)合位點(diǎn),該蛋白還存在16個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn),21個(gè)酪蛋白激酶2磷酸化位點(diǎn),3個(gè)cAMP-/cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點(diǎn),PPV-SC1 NS1蛋白與POX_D5(痘病毒D5蛋白)具有一致的保守結(jié)構(gòu)域,推測(cè)NS1可能與POX_D5有類似的