Ⅱ型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1免疫檢測方法的建立.pdf

1、本研究以II型登革病毒NS1蛋白為研究靶抗原，對II型登革病毒標(biāo)準(zhǔn)株NS1基因的克隆、蛋白表達(dá)純化和復(fù)性以及其抗原性的鑒定，用該蛋白與滅活I(lǐng)I型登革病毒交替免疫Balb／c小鼠，制備了一批針對II型登革病毒NS1蛋白的血清型特異性單克隆抗體，并建立了基于II型登革病毒NS1血清型特異性單克隆抗體的雙抗體夾心ELISA法診斷檢測方法，該方法既能對登革病毒感染者作出快速準(zhǔn)確的早期診斷，又能對感染者作出分型診斷，此外其操作簡便，成本低廉，并能

2、實(shí)現(xiàn)登革熱大規(guī)模爆發(fā)流行時的高通量篩查工作，為登革病毒感染的早期診斷和分型診斷提供了方法依據(jù)。 本研究主要分三個部分： 第一部分：II型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的克隆表達(dá)及抗原性鑒定 提取II型登革病毒總RNA，RT-PCR法擴(kuò)增非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的全長基因，經(jīng)TA克隆后，定向連接到原核表達(dá)載體pQE30中，經(jīng)過篩選鑒定，獲得穩(wěn)定表達(dá)DV2-NS1蛋白的菌株。通過對表達(dá)條件及純化條件的優(yōu)化，經(jīng)Ni-NTA親和層析純

3、化，并經(jīng)倍比稀釋復(fù)性，最終獲得可溶性的DV2-NS1蛋白，獲得的蛋白經(jīng)ELISA和WesternBlot鑒定，該蛋白與抗四型登革病毒NS1蛋白交叉單抗(7E9A2)特異結(jié)合，說明獲得的DV2-NS1蛋白具有良好的抗原性，為下一步制備DV2-NS1蛋白特異性單克隆抗體奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。 第二部分：II型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1血清型特異性單克隆抗體的制備與鑒定 利用獲得具有良好抗原性的DV2-NS1蛋白，制備II型登革病毒非

4、結(jié)構(gòu)蛋白NS1血清型特異性的單克隆抗體，并對抗體進(jìn)行免疫學(xué)特性研究和血清型特異性鑒定。采用重組DV2-NS1蛋白與滅活的II型登革病毒混合免疫Balb／c小鼠，取其脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，分別用重組DV2-NS1蛋白和DV2病毒作為抗原，間接ELISA法進(jìn)行篩選，結(jié)合免疫熒光(IFA)鑒定，經(jīng)過多次融合篩選，最終獲得了37株穩(wěn)定分泌抗DV2-NS1蛋白的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)間接ELISA和IFA進(jìn)一步鑒定，其中有23株與登革病

5、毒其他3個血清型存在不同程度的交叉反應(yīng)，另有14株DV2-NS1單克隆抗體為II型登革病毒NS1血清型特異性抗體，該14株抗體與登革病毒其他3個血清型均無交叉結(jié)合反應(yīng)，僅特異結(jié)合DV2-NS1重組蛋白和II型登革病毒，經(jīng)WesternBlot證實(shí)，該14株抗體結(jié)合位置在41KD處，與預(yù)測的NS1蛋白分子量一致。亞類測定14株血清型特異性單克隆抗體，其中兩株為IgG2b，余均為IgG1。這些血清型特異性抗體的獲得為下一步建立II型登革病毒

6、非結(jié)構(gòu)蛋白NS1雙抗體夾心ELISA法的診斷檢測方法奠定了基礎(chǔ)。 第三部分：II型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1雙抗體夾心ELISA的建立 在獲得了14株血清型特異性抗DV2-NS1蛋白單克隆抗體細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，制備腹水，純化抗體，用生物素標(biāo)記抗體，并檢測每株抗體效價，分析單抗識別抗原位點(diǎn)，進(jìn)行組合配對并篩選出最佳的抗體配對組合。14株血清型特異性DV2-NS1抗體經(jīng)生物素(Biotin)標(biāo)記后，采用相互競爭抑制實(shí)驗(yàn)分析單抗識

7、別抗原位點(diǎn)，結(jié)果顯示14株特異性單抗識別4個不完全相同的抗原位點(diǎn)。并利用單抗識別位點(diǎn)不同，進(jìn)行單抗間的兩兩配對，將每一株抗體作為捕獲抗體分別與其他不同抗原位點(diǎn)生物素標(biāo)記單抗作為檢測抗體進(jìn)行相互配對實(shí)驗(yàn)，用II型登革病毒培養(yǎng)上清及重組DV2-NS1蛋白作為捕獲抗原，進(jìn)行最佳組合篩選，同時結(jié)合I型登革病毒及稀釋液的本底值，經(jīng)反復(fù)多次篩選，最終確定了以單克隆抗體4D41A6為捕獲抗體，生物素標(biāo)記的單克隆抗體5A47A8為檢測抗體的最佳組合方案

8、，用于構(gòu)建II型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1雙抗體夾心ELISA診斷檢測方法。建立的雙抗體夾心抗原捕獲法檢測重組的DV2-NS1蛋白，其靈敏度為3.9ng／ml，其線性檢測范圍為10～100ng／ml。進(jìn)一步檢測不同血清型的登革病毒毒株和其他黃病毒的病毒液，結(jié)果顯示，利用II型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1血清型特異性抗體建立的診斷方法，只特異結(jié)合II型登革病毒，而與其他病毒無交叉反應(yīng)，具有血清型特異性。建立的基于II型登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1雙

9、抗體夾心ELISA診斷檢測方法具有高度敏感性和血清型特異性，為登革病毒感染的分型診斷和鑒別診斷提供了一種新的實(shí)驗(yàn)室診斷學(xué)方法。 綜上所述，本研究得到如下的結(jié)論： 一、成功獲得具有良好抗原性的可溶性DV2-NS1蛋白，并制備了一批抗登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1的單克隆抗體，其中23株為混合交叉型，與4個血清型登革病毒存在不同程度結(jié)合，另有14株為II型登革病毒NS1蛋白血清型特異性單克隆抗體，為建立II型登革病毒免疫學(xué)診斷方法