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文檔簡介
1、目的:首先構建人過氧化物酶體增殖體激活受體γ2(hPPAR-γ2)和人β3腎上腺素受體基因(野生型、突變型)全長cDNA克隆及真核表達載體peDNA3.1(+)/hPPAR-γ2,pcDNA3.1(+)/hβ3-AR;然后將人β3-AR重組表達載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR穩(wěn)定轉染到人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)中進行表達;其次在建立的人穩(wěn)定表達細胞系中,研究PPAR-γ2受體對β3-AR表達水平的調節(jié)。 方法:
2、1.從中國漢族人腎旁脂肪組織提取總RNA,應用RT-PCR方法擴增出hPPAR-γ2,hβ3-AR cDNA基因的全長;將RT-PCR產物雙酶切與同樣進行雙酶切的pcDNA3.1(+)載體連接形成重組載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR,pcDNA3.1(+)/hPPAR-γ2。2.用電穿孔法將人hβ3-AR重組表達載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR(突變型和野生型)轉染到SH-SY5Y細胞中,用G418篩選獲取陽性穩(wěn)定轉染細
3、胞株,并用RT-PCR、Westem-blot的方法進行鑒定。3.利用構建的穩(wěn)定表達人β3-AR的SH-SY5Y的細胞株(本身表達PPAR-γ2受體),將細胞分為兩組:轉染細胞+不加藥,轉染細胞+加藥,同時加藥組,給予不同濃度的藥物孵育,觀察細胞在羅格列酮(一種特異性PPAR-γ2激動劑)處理后,β3-AR蛋白表達水平的變化。 結果:1.從脂肪組織RNA中分別擴增得到1544bp(hβ3-AR)和1578bp(hPPAR-γ2)
4、的目的基因片斷,構建了人野生型和突變型的PPAR-γ2、β3-AR的真核表達重組體pcDNA3.1(+)/hPPAR-γ2、pcDNA3.1(+)/hβ3-AR。 2.獲經G418抗性篩選后,得到生長良好的單細胞克隆。RT PCR結果顯示,經pcDNA3.1(+)/hβ3-AR轉染的G418抗性SH-SY5Y細胞可擴增出的目的條帶;Western-blot結果顯示,pcDNA3.1(+)/hβ3-AR轉染的G418抗性SH-SY
5、5Y細胞有一條約45KD的蛋白條帶,其大小與hβ3-AR相符。 3.轉染野生型β3-AR受體的細胞在30μmol/L羅格列酮藥物孵育24h后,β3-AR表達水平明顯下降,而轉染突變型β3-AR受體的細胞藥物孵育后,受體表達水平也顯著下降,但兩者間無顯著差異且受體水平的下調與孵育藥物的濃度相關。 結論:本研究克隆了人PPAR-γ2,β3-AR基因全長cDNA并成功構建了人野牛型和突變型的PPAR-γ2、β3-AR的真核表達
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