β3-AR基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建及PPAR-γ2受體對(duì)其表達(dá)的調(diào)節(jié).pdf

1、目的：首先構(gòu)建人過(guò)氧化物酶體增殖體激活受體γ2(hPPAR-γ2)和人β3腎上腺素受體基因(野生型、突變型)全長(zhǎng)cDNA克隆及真核表達(dá)載體peDNA3.1(+)/hPPAR-γ2，pcDNA3.1(+)/hβ3-AR；然后將人β3-AR重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y)中進(jìn)行表達(dá)；其次在建立的人穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系中，研究PPAR-γ2受體對(duì)β3-AR表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。 方法：

2、1．從中國(guó)漢族人腎旁脂肪組織提取總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法擴(kuò)增出hPPAR-γ2，hβ3-AR cDNA基因的全長(zhǎng)；將RT-PCR產(chǎn)物雙酶切與同樣進(jìn)行雙酶切的pcDNA3.1(+)載體連接形成重組載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR，pcDNA3.1(+)/hPPAR-γ2。2．用電穿孔法將人hβ3-AR重組表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/hβ3-AR(突變型和野生型)轉(zhuǎn)染到SH-SY5Y細(xì)胞中，用G418篩選獲取陽(yáng)性穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)

3、胞株，并用RT-PCR、Westem-blot的方法進(jìn)行鑒定。3．利用構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)人β3-AR的SH-SY5Y的細(xì)胞株(本身表達(dá)PPAR-γ2受體)，將細(xì)胞分為兩組：轉(zhuǎn)染細(xì)胞+不加藥，轉(zhuǎn)染細(xì)胞+加藥，同時(shí)加藥組，給予不同濃度的藥物孵育，觀察細(xì)胞在羅格列酮(一種特異性PPAR-γ2激動(dòng)劑)處理后，β3-AR蛋白表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：1．從脂肪組織RNA中分別擴(kuò)增得到1544bp(hβ3-AR)和1578bp(hPPAR-γ2)

4、的目的基因片斷，構(gòu)建了人野生型和突變型的PPAR-γ2、β3-AR的真核表達(dá)重組體pcDNA3.1(+)/hPPAR-γ2、pcDNA3.1(+)/hβ3-AR。 2．獲經(jīng)G418抗性篩選后，得到生長(zhǎng)良好的單細(xì)胞克隆。RT PCR結(jié)果顯示，經(jīng)pcDNA3.1(+)/hβ3-AR轉(zhuǎn)染的G418抗性SH-SY5Y細(xì)胞可擴(kuò)增出的目的條帶；Western-blot結(jié)果顯示，pcDNA3.1(+)/hβ3-AR轉(zhuǎn)染的G418抗性SH-SY

5、5Y細(xì)胞有一條約45KD的蛋白條帶，其大小與hβ3-AR相符。 3．轉(zhuǎn)染野生型β3-AR受體的細(xì)胞在30μmol/L羅格列酮藥物孵育24h后，β3-AR表達(dá)水平明顯下降，而轉(zhuǎn)染突變型β3-AR受體的細(xì)胞藥物孵育后，受體表達(dá)水平也顯著下降，但兩者間無(wú)顯著差異且受體水平的下調(diào)與孵育藥物的濃度相關(guān)。 結(jié)論：本研究克隆了人PPAR-γ2，β3-AR基因全長(zhǎng)cDNA并成功構(gòu)建了人野牛型和突變型的PPAR-γ2、β3-AR的真核表達(dá)