2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、科學(xué)研究中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,抗體工程和細(xì)胞工程領(lǐng)域篩選種子細(xì)胞經(jīng)常需要兩個(gè)或以上的基因穩(wěn)定共表達(dá)。通常通過(guò)兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染的篩選方法來(lái)實(shí)現(xiàn),然而實(shí)踐中常面對(duì)許多問(wèn)題。因此,有必要開(kāi)發(fā)單個(gè)載體實(shí)現(xiàn)多基因共同表達(dá)。MDCK細(xì)胞作為流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞系之一,廣泛應(yīng)用于多種病毒的擴(kuò)增與純化。但是MDCK細(xì)胞貼壁依賴性強(qiáng),需要表面粘附來(lái)進(jìn)行增殖。因此實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞于懸浮培養(yǎng)中增殖,將簡(jiǎn)化病毒生產(chǎn)過(guò)程,并極大地促進(jìn)流感病毒的生產(chǎn)規(guī)模。

2、r>  本文對(duì)多基因共穩(wěn)定表達(dá)篩選載體與siat7e穩(wěn)轉(zhuǎn)MDCK細(xì)胞株的構(gòu)建進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分:
  第一部分:IRES序列的多基因共穩(wěn)定表達(dá)篩選載體構(gòu)建。
  目的:構(gòu)建一個(gè)IRES序列介導(dǎo)的多基因共表達(dá)載體,實(shí)現(xiàn)兩個(gè)目的基因和篩選標(biāo)記基因共用一個(gè)啟動(dòng)子高效表達(dá),提高多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株的篩選效率。
  方法:以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的載體pLV-MCS-Puro為骨架,設(shè)計(jì)并全基因合成雙基因克隆表達(dá)元件,連接

3、到骨架載體,構(gòu)建多基因共表達(dá)載體pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP熒光蛋白基因驗(yàn)證該載體用于多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株篩選的效率。
  結(jié)果:成功構(gòu)建了pLV-2MCS-Puro載體以及DsRed2和EGFP共表達(dá)重組質(zhì)粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明該載體能介導(dǎo)多基因共表達(dá)??剐院Y選獲得了MDCK和Hela兩種細(xì)胞的多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞池。細(xì)胞池涂片熒光顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)表明抗性細(xì)胞池Ds

4、Red2和EGFP雙陽(yáng)率接近100%?;蚪M和轉(zhuǎn)錄水平PCR及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明DsRed2和EGFP穩(wěn)定整合到抗性細(xì)胞基因組并且兩種蛋白表達(dá)水平較為一致。
  結(jié)論:成功構(gòu)建了多基因共表達(dá)載體pLV-2MCS-Puro,實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)目的基因和抗性基因串聯(lián)共表達(dá),并且具有高效的多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株篩選效率。該載體在研究蛋白相互作用以及工程細(xì)胞構(gòu)建等方面具有一定的應(yīng)用前景。
  第二部分:siat7e基因穩(wěn)定表達(dá)的MDCK細(xì)

5、胞株的構(gòu)建。
  目的:構(gòu)建表達(dá)siat7e的MDCK細(xì)胞株,用以解決MDCK細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)問(wèn)題。
  方法:利用PCR技術(shù),從MDCK細(xì)胞基因組中擴(kuò)增出全長(zhǎng)1011 bp的siat7e基因,并將該基因分別克隆到pBflag、pLV-MCS-Puro和pSF-EGFP表達(dá)載體中,三種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后,篩選siat7e基因穩(wěn)定表達(dá)的MDCK細(xì)胞株,以期實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞適應(yīng)無(wú)血清懸浮培養(yǎng)。
  結(jié)果:成功構(gòu)建

6、了pBflag-siat7e、pLV-siat7e-Puro、pSF-EGFP-siat7e三種表達(dá)質(zhì)粒。pBflag-siat7e重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,抗性篩選獲得四個(gè)克隆,蛋白質(zhì)印記和基因組PCR未見(jiàn)siat7e目的條帶,推測(cè)可能未篩選到siat7e陽(yáng)性克隆,且細(xì)胞未見(jiàn)明顯表型。pLV-siat7e-Puro重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞,抗性篩選獲得MDCK耐藥細(xì)胞池?;蚪M和轉(zhuǎn)錄水平PCR都證明目的基因siat7e穩(wěn)定整合到MDC

7、K細(xì)胞基因組。同樣細(xì)胞未見(jiàn)明顯表型,降低血清或者無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)耐藥性MDCK細(xì)胞,未獲得適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系。利用pSF-EGFP-siat7e重組載體,融合表達(dá)EGFP和siat7e蛋白,熒光定位siat7e蛋白。熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP熒光蛋白表達(dá)情況,驗(yàn)證siat7e基因成功轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞?;蚪M和轉(zhuǎn)錄水平PCR驗(yàn)證,證明siat7e基因穩(wěn)定整合到MDCK細(xì)胞基因組。蛋白熒光定位驗(yàn)證siat7e表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶

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