豬瘟病毒E2基因乳腺特異表達載體的構(gòu)建與細胞表達的研究.pdf

1、豬瘟是對養(yǎng)豬業(yè)危害嚴重的一種A類傳染病,其致病原是豬瘟病毒(CSFV).E2囊膜糖蛋白是CSFV的主要保護性抗原蛋白,應(yīng)用真核細胞表達系統(tǒng)表達的E2蛋白免疫動物,對強毒的攻擊有較好的保護作用.利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)有經(jīng)濟價值的生物活性蛋白已成為當(dāng)前生物領(lǐng)域研究的熱點,制備乳腺生物反應(yīng)器的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是構(gòu)建高效、特異的表達載體,而β-乳球蛋白(BLG)是反芻動物乳汁中特異的主要乳清蛋白.該研究以牛β-乳球蛋白基因上游調(diào)控成分作為啟動子,利用該

2、實驗室已有的豬瘟病毒E2基因,構(gòu)建了E2基因的乳腺特異表達載體,并通過電穿孔方法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞,以驗證表達載體構(gòu)建的合理性和E2蛋白的表達效率.并借助抗性基因Kana/neo(卡那霉素/新霉素抗性基因)和報告基因EGFP(增強型綠色熒光蛋白報告基因)來篩選、純化陽性克隆細胞,為利用核移植技術(shù)制作轉(zhuǎn)基因動物提供細胞來源,同時也為豬瘟基因工程疫苗的研究提供了一種手段.研究結(jié)果如下:利用PCR方法從奶牛血中克隆了牛β-乳球蛋白基

3、因上游調(diào)控成分(737bp),其中包括5'側(cè)翼序列(645bp)和第一外顯子中信號肽序列(92bp).PCR產(chǎn)物回收純化后,克隆在pMD 18-T載體的T位點.序列分析表明,該序列與Genbank中已有序列同源性均大于90%.DNA Star分析表明,此調(diào)控成分含有多種調(diào)節(jié)因子結(jié)合位點或反應(yīng)元件,包括視黃酸反應(yīng)元件(RARE)、佛波酯反應(yīng)元件(TRE)、乳腺特異性因子(MSBF)和核因子1(NF1)結(jié)合位點等,這提示此調(diào)節(jié)元件可調(diào)控外源

4、基因在乳腺細胞中表達,可進一步用于構(gòu)建乳腺特異表達載體.通過重組PCR方法,將克隆的牛BLG上游調(diào)控成分與豬瘟病毒E2基因連接起來,并克隆到pMD 18-T載體的T位點,形成pBE質(zhì)粒.HindⅢ/Xba Ⅰ、Ase Ⅰ酶切pBE質(zhì)粒,獲得BE片段.真核表達質(zhì)粒pEGFP-C1在經(jīng)Ase Ⅰ單酶切和5'端去磷酸化處理后,與BE片段經(jīng)T4 DNA連接酶連接起來,構(gòu)建了豬瘟病毒E2基因的乳腺特異表達載體.此載體含有報告基因EGFP(增強型綠