Mdr1真核表達載體的構建及肝癌耐藥細胞株HepG2-mdr1的篩選.pdf

1、肝細胞癌(Hepatocellarcancinoma，HCC)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，目前已占所有惡性腫瘤5％以上，全球每年死于肝癌的病人超過500萬人。在我國肝癌已成為惡性腫瘤的第二大病因，每年死于肝癌的病人列全球第一位。根治性手術治療是肝癌治療的首選方法，但臨床上適合于根治性治療的患者只占全部肝癌患者的30％～40％，因此，化療是是當今肝癌治療的重要方法之一。在腫瘤化療過程中，多藥耐藥(Multidrugresistance，MDR

2、)的產(chǎn)生一直是影響其療效的首要因素，是腫瘤化療急需解決的難題和研究的熱點。 多藥耐藥細胞株是研究MDR現(xiàn)象的主要工具之一，目前建立多藥耐藥細胞系的方法主要是在體外用抗癌藥物逐漸誘導的方法。但此方法建立的MDR細胞系，誘導時間長，誘導后細胞的生物特性和敏感性發(fā)生差異，當處于無化療藥物培養(yǎng)時，穩(wěn)定性較差，耐藥性往往發(fā)生丟失。另外，由該方法建立的細胞株產(chǎn)生MDR的機制復雜，至少有Pgp和MRP等兩種機制參與，這不利于對MDR現(xiàn)象中單一

3、機制和逆轉(zhuǎn)的研究，尤其是目前比較熱門的利用反義寡核苷酸、核酶及RNA干擾等基因方法逆轉(zhuǎn)肝細胞癌抗藥表型的研究。因此，通過生物轉(zhuǎn)基因方法建立MDR細胞系，其生物特性和敏感性相同，MDR的機制單一，當處于無化療藥物培養(yǎng)時，穩(wěn)定性較好，不會發(fā)生耐藥性丟失，將克服上述細胞模型的缺點。目前，利用該方法建立的MDR細胞系在膀胱癌、鱗狀細胞癌等已有報道，但在肝癌中，迄今為止，國內(nèi)外尚未見報道?；诖耍覀冊O想通過基因?qū)氲姆椒?，將MDR基因克隆到肝癌

4、細胞株，使其表達有功能的多藥耐藥蛋白，產(chǎn)生穩(wěn)定的耐藥性，從而建立一系列肝癌MDR細胞系，將為深入其MDR提供理想的細胞模型。 目的①構建多藥耐藥基因(mdr1)真核表達載體PCI-neo-mdr1，轉(zhuǎn)染人肝癌細胞株HepG2細胞，篩選出人肝癌多藥耐藥細胞株HepG2/mdr1細胞。②觀察HepG2/mdr1細胞生物學特性和體內(nèi)、外耐藥性及反義RNA對其耐藥性的逆轉(zhuǎn)，探討其耐藥機理，為深入研究肝癌的MDR及其逆轉(zhuǎn)提供理想的細胞模型

5、。③探索建立肝癌MDR細胞株的新方法，為肝癌MDR的研究提供技術平臺。 方法雙酶切攜帶有mdr1cDNA的質(zhì)粒PHAmdr1，獲取mdr1cDNA，亞克隆到真核表達載體PCI-neo的多克隆位點，構建重組質(zhì)粒PCI-neo-mdr1；酶切鑒定后，脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)然HepG2細胞，G418篩選克隆陽性細胞，阿霉素(Adruamycin,ADM)短暫誘導P-gp的表達，篩選出肝癌多藥耐藥細胞株HepG2/mdr1細胞。提取HepG2/md

6、r1細胞的總DNA，PCR擴增mdr1特異片斷以檢測mdr1基因的表達狀況；MTT法檢測HepG2/mdr1細胞的生長曲線及對ADM和絲裂霉素(Mitomycin,MMC)的半數(shù)致死量(IC50)，以觀察HepG2/mdr1細胞的生長情況和多藥耐藥性；RT-PCR檢測HepG2/mdr1細胞的mdr1mRNA及流式細胞儀(Flowcytometry,FCM)檢測其P-gp的表達和對柔紅霉素(Daunorubicin,DNR)的蓄積，以觀

7、察mdr1基因在HepG2細胞中的轉(zhuǎn)錄和翻譯情況及其表達產(chǎn)物P-gp的功能。觀察攜帶反義mdr1基因片段的重組腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr1對HepG2/mdr1細胞耐藥性的逆轉(zhuǎn)，以探討HepG2/mdr1細胞MDR機理。裸鼠皮下成瘤實驗，以觀察HepG2/mdr1細胞的成瘤性和體內(nèi)耐藥性。 結果成功構建了攜帶mdr1cDNA的重組真核表達載體PCI-neo-mdr1并能夠高效率的轉(zhuǎn)然HepG2細胞；PCR能夠在He

8、pG2/mdr1細胞中擴增出而在其親代細胞HepG2細胞中并無mdr1特異性片斷，說明重組真核表達載體PCI-neo-mdr1能夠成功地將mdr1cDNA導入HepG2細胞，而HepG2細胞本身不含目的基因mdr1cDNA；MTT的結果發(fā)現(xiàn)HepG2/mdr1細胞的生長曲線，與其親代細胞HepG2細胞相比，并無明顯差異，而其對ADM和MMC的IC50分別為25ug/ml和10ug/ml，較其親代細胞HepG2細胞分別增加了35倍和125

9、倍，說明mdr1的導入并沒有明顯影響宿主細胞的生長，而是增加其MDR；HepG2/mdr1細胞mdr1mRNA和P-gp的表達均明顯增加，較其親代細胞HepG2細胞均增加了分別約2倍和3倍，而HepG2/mdr1細胞MRP的表達增加卻不明顯，差異性無顯著意義(P＞0.05)，P-gp的特異性底物DNR在HepG2/mdr1細胞中的蓄積明顯減少，差異性有顯著意義(P＜0.05)，說明導入的mdr1基因在宿主細胞中能夠穩(wěn)定表達有功能的P-g

10、p，從而增加其多藥耐藥性；在體外感染重組腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr148h后，HepG2/mdr1細胞恢復了對化療藥物的敏感性，其對ADM的IC50和RF分別為3ug/ml和3.4，較未感染的HepG2/mdr1細胞對ADM的IC50和RF分別下降7.7倍和13.4倍。感染腺病毒48h后HepG2/mdr1細胞mdr1mRNA和P-gp的表達呈下降，對DNR的蓄積增加；與未感染的HepG2/mdr1細胞相比，差異性有顯著意

11、義(P＜0.05)，但較其親代細胞HepG2細胞差異性不顯著(P＞0.05)，說明攜帶反義mdr1基因片段的重組腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr1幾乎能夠完全逆轉(zhuǎn)HepG2/mdr1細胞的耐藥性，結合本研究小組前期研究結果，重組腺病毒pAdEasy-GFP-ASmdr1只能部分逆轉(zhuǎn)肝癌MDR細胞株SMMC7721/ADM的MDR，這也從另一方面證明了HepG2/mdr1細胞的耐藥機理明確、單一，有利于對肝癌MDR的研究，較體外用

12、抗癌藥物逐漸誘導的方法建立的肝癌MDR細胞株SMMC7721/ADM有明顯的優(yōu)越性；在裸鼠肝癌移植瘤模型中，HepG2/mdr1細胞組和對照HepG2細胞組的平均成瘤時間分別是13.00±2.16d和12.75±2.22d，成瘤率均為100％。給予ADM后，HepG2/mdr1細胞組移植瘤的體積增長快于HepG2細胞組，其腫瘤生長率為7.35±0.77和4.83±0.72，相對于HepG2/mdr1組，ADM對HepG2組腫瘤抑制率為4

13、4.6％。 結論①利用雙酶切法能夠成功構建攜帶mdr1全長基因片段的重組真核載體質(zhì)粒PCI-neo-mdr1；②目的基因mdr1cDNA在宿主細胞人肝癌細胞株HepG2細胞能夠高效表達有功能的P-gp，增加宿主細胞的MDR；③利用基因克隆的方法將mdr1cDNA導入HepG2細胞，建立肝癌MDR細胞株，該方法簡單易行，為MDR細胞株的建立奠定一定的理論基礎；④利用基因克隆法建立的MDR細胞株，其MDR機理明確、單一，較體外用抗癌